Udvikling af en noninvasive, Laser-Assisteret eksperimentel model af Hornhinde Endotel Cell Loss
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at frigøre hornhinde endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjælp af en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sygdom model for bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasere er blevet brugt til at udføre noninvasive intraokulær kirurgi, såsom capsulotomy i flere årtier nu. Den skarpe effekt er afhængig af den optiske opdeling på laser fokus. Akustiske chokbølger og kavitationsbobler genereres, hvilket forårsager vævsbrud. Boblestørrelser og trykamplitudes varierer med pulsenergi og position af omdrejningspunktet. I denne undersøgelse, enucleated svin øjne var placeret foran en kommercielt tilgængeligE Nd: YAG laser. Variable puls energier samt forskellige positioner af brændpunkterne posteriort til hornhinden blev testet. Resulterende læsioner blev evalueret ved to-foton mikroskopi og histologi for at bestemme de bedste parametre for en eksklusiv løsrivelse af hornhinde endotelceller (CEC) med minimal følgeskader. Fordelene ved denne metode er den præcise ablation af CEC, reduceret følgeskader, og frem for alt, den ikke-kontakt behandling.
Introduction
Gennemsigtighed af hornhinden er afgørende for transmission af lys til nethinden og dens fotoreceptorer1. I denne henseende er en relativ tilstand af dehydrering afgørende for at holde kollagen fibre i hornhinden stroma korrekt justeret. Denne homøostase vedligeholdes af hornhindeens endotelceller (CEC), der er placeret på Descemets membran (DM)2. Endotel er det inderste hornhindelag. Det har en vigtig barriere og pumpe funktion, som er afgørende for hornhinde gennemsigtighed3. I modsætning til epitel, endotel er ikke i stand til selvforny4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaget af sygdom eller traumer de resterende endotelceller til at forstørre og migrere, for at dække resulterende defekter og for at opretholde hornhindens funktionalitet5. Men hvis CEC tæthed falder til under en kritisk tærskel, decompensation af endotel fører til et ødem, resulterer i sløret syn og ubehag eller endda alvorlige smerter4. På trods af tilgængeligheden af lægemidler til at lindre symptomerne, i øjeblikket den eneste endelige behandling i disse tilfælde er hornhinde transplantation, som kan udføres i form af en fuld tykkelse graft eller en lamel endotel transplantation. Sidstnævnte procedure er tilgængelig som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemet’s stripping automatiseret endotel keratoplasty (DSAEK)6. Men beskyttelsen af resterende CEC og forbedre deres overlevelse kunne være et alternativt mål, som har brug for en passende sygdommodel til at teste potentielle terapeutiske lægemidler.
De nuværende CEC-tabssygdomsmodeller fokuserer på ødelæggelse af endotel ved injektion af giftige agenser (f.eks. benzalkoniumchlorid) i det forreste kammer eller ved mekanisk slid af cellerne ved hjælp af en invasiv descemetorhexis-teknik7,8. Mens disse modeller er veletablerede, ulemper såsom generel inflammatorisk respons og upræcise følgeskader findes. Derfor er disse modeller er mere tilbøjelige til at repræsentere de sidste stadier af sygdommen, når de ovennævnte kirurgiske muligheder er uundgåelige.
Med fremskridt inden for cellulære behandlingsstrategier såsom stamceller og genterapi kan anvendelsen af disse cellulære behandlinger være nyttig i de tidlige stadier af CEC-tab9. Derefter har vi brug for en model, der repræsenterer disse tidligere stadier af sygdommen mere hensigtsmæssigt. I denne henseende er cellekulturmodellerne blevet bedre i løbet af det seneste årti, men er stadig begrænset i deres gyldighed, da celler in vitro ikke kan komme tæt på at gentage de komplekse interaktioner, der opstår mellem de forskellige celletyper i hornhinden10. Derfor er ex vivo og in vivo sygdom modeller stadig i høj efterspørgsel og forbedre de eksisterende er af største interesse.
Noninvasive, intraokulær kirurgi ved photodisruption ved hjælp af en neodym: YAG (Nd:YAG) laser er blevet en rutinemæssig procedure for øjenlæger over hele verden siden dens indførelse i slutningen af 1970’erne11. Photodisruption er afhængig af ikke-lineær lysabsorption, der fører til dannelse af plasma, generation af akustiske chokbølger, og skabelse af kavitationsbobler, når påføringsstedet er placeret i et flydende miljø12. Generelt bidrager disse processer til den tilsigtede virkning af præcis vævsskæring. Men, de kan også være kilden til unødvendige følgeskader begrænse den lokale indespærring af laser kirurgi13.
Forudsigelsen af de deraf følgende mekaniske virkninger er blevet væsentligt forbedret gennem karakterisering af chokbølgen formering og kavitation kursus. Det er vores mål at målrette CEC med så lidt skade på omgivende væv som muligt at give en noninvasive, laser-assisteret eksperimentel sygdom model for de tidlige stadier af CEC tab. Til dette formål er det nødvendigt at bestemme de optimale pulsenergier og positioner af laserens brændpunkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultaterne af denne pilotundersøgelse viser, at en Nd:YAG-laser kan anvendes til selektivt at ablate hornhinde endotelceller, når der vælges passende parametre for energidosis og fokuspunktsposition.
Da endotelfunktionen er vigtig for hornhindens gennemsigtighed og beskyttelse af hornhinden mod stromale ødem, spiller modeller af endoteldysfunktion en vigtig rolle i udviklingen af anti-ødemerende lægemidler eller kirurgiske procedurer. Der er flere etablerede in vitro modeller til efter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjælp med eksperimentelle metoder.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
Riferimenti
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal – American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
