角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発
Summary
ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。
Abstract
Nd:YAGレーザーは、数十年前からカプロートミーなどの非侵襲的な眼内手術を行うために使用されてきました。切開効果は、レーザーフォーカスでの光学的破壊に依存します。音響衝撃波とキャビテーション気泡が発生し、組織が破裂する原因となります。バブルサイズと圧力振幅は、パルスエネルギーと焦点の位置によって変化します。本研究では、生核ブタの目を市販のNd:YAGレーザーの前に配置した。可変パルスエネルギーならびに角膜後方の焦点スポットの異なる位置が試験された。結果として生じる病変を2光子顕微鏡および組織学によって評価し、最小の副次的損傷を伴う角膜内皮細胞(CEC)の排他的剥離に対する最良のパラメータを決定した。この方法の利点は、CECの正確な切り取り、担保損傷の減少、そして何よりも非接触治療です。
Introduction
角膜の透明性は、光をレティナおよびその光受容体1に伝達するために不可欠である。この点に関して、脱水の相対的な状態は、角膜間質内のコラーゲン線維を正しく整列させるために重要である。この恒常性は、デセメットの膜(DM)2に位置する角膜内皮細胞(CEC)によって維持される。内皮は最も内側の角膜層である。それは重要な障壁およびポンプ機能を有し、角膜の透明性3にとって極めて重要である。上皮とは対照的に、内皮は自己更新できない4.したがって、疾患または外傷によって引き起こされる細胞損傷は、残りの内皮細胞を刺激して拡大および移動し、生じる欠陥をカバーし、角膜機能を維持する5。しかし、CEC密度が臨界閾値を下回ると、内皮の代償不全が浮腫につながり、視力がぼやけ、不快感や重度の痛み4を生じる。症状を緩和する薬剤が利用可能であるにもかかわらず、現在、これらの症例における唯一の決定的な治療法は角膜移植であり、これは全厚移植片または薄膜内皮移植の形で行うことができる。後者の手順は、デシェメットの膜内皮角膜形成術(DMEK)ならびにデスセメットのストリッピング自動内皮角膜形成術(DSAEK)6として利用可能である。6しかし、残りのCECの保護とその生存率の向上は、潜在的な治療薬をテストするのに十分な疾患モデルを必要とする代替ターゲットとなり得る。
現在のCEC損失疾患モデルは、前房への毒性物質(例えば、塩化ベンザルコニウム)の注入を介した内皮の破壊に焦点を当てるか、侵襲的なデセメトヘキシス法77,88を用いて細胞の機械的摩耗によって。これらのモデルは十分に確立されていますが、一般的な炎症反応や不正確な担保損傷などの欠点があります。したがって、これらのモデルは、上記の外科的選択肢が避けられない場合に、疾患の最終段階を表す可能性が高い。
幹細胞や遺伝子治療などの細胞治療戦略の進歩に伴い、これらの細胞療法の適用はCEC損失9の初期段階で有用であり得る。その後、これらの疾患の初期段階をより適切に表すモデルが必要です。この点で、細胞培養モデルは過去10年間で改善されたが、インビトロの細胞が角膜10内の異なる細胞型間で起こる複雑な相互作用を複製することに近づくことができないため、その有効性は依然として制限されている。したがって、ex vivoおよびin vivo疾患モデルは依然として高い需要があり、既存のものを改善することは最大の関心事です。
ネオジムを用いた光破壊による非侵襲的な眼内手術:YAG(Nd:YAG)レーザーは、1970年代後半11年に導入されて以来、世界中の眼科医にとって日常的な処置となっている。光破壊は、液体環境12に位置する場合は常に、プラズマの形成、音響衝撃波の発生、およびキャビテーション気泡の生成につながる非線形光吸収に依存する。一般に、これらのプロセスは、正確な組織切断の意図された効果に寄与する。しかし、それらはまた、レーザー手術13の局所的な閉じ込めを制限する不必要な担保損傷の源であり得る。
衝撃波伝搬とキャビテーションコースの特性評価により、機械的効果の予測が大幅に向上しました。私たちの目標は、CECの損失の初期段階のための非侵襲的な、レーザー支援実験疾患モデルを提供するために、周囲の組織への損傷をできるだけ少なくしてCECを標的にすることです。そのためには、レーザーの焦点スポットの最適なパルスエネルギーと位置を決定する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この試験試験研究の結果は、エネルギー線量および焦点点位置に適切なパラメータが選択された場合に、Nd:YAGレーザーを使用して角膜内皮細胞を選択的にアブレートできることを示している。
内皮機能は角膜の透明性と角膜浮腫からの保護にとって重要であるため、内皮機能不全のモデルは抗浮腫薬または外科的処置の開発において重要な役割を果たす。インビボシチ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クリスティーン・オリュンとヤン・A・M・ソチュレックの実験方法に対する支援に感謝します。
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
Riferimenti
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