Utvikling av en ikke-invasiv, laserassistert eksperimentell modell av hornhinne endotelcelletap
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å løsne hornhinne endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjelp av en neodymium:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sykdommodell for bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasere har blitt brukt til å utføre ikke-invasiv intraokulær kirurgi, som capsulotomy i flere tiår nå. Den incisive effekten er avhengig av den optiske nedbrytningen ved laserfokus. Akustiske sjokkbølger og kavitasjonsbobler genereres, noe som forårsaker vevsbrudd. Boblestørrelser og trykkamplituder varierer med pulsenergi og fokuspunkt. I denne studien ble enucleated svineøyne plassert foran en kommersielt tilgjengelig Nd:YAG laser. Variabel pulsenergier samt ulike posisjoner av brennplassene posterior til hornhinnen ble testet. Resulterende lesjoner ble evaluert av tofotonmikroskopi og histologi for å bestemme de beste parametrene for en eksklusiv løsrivelse av hornhinneendotelceller (CEC) med minimal sikkerhetsskade. Fordelene med denne metoden er nøyaktig ablasjon av CEC, redusert sikkerhet skade, og fremfor alt, ikke-kontakt behandling.
Introduction
Gjennomsiktighet av hornhinnen er avgjørende for overføring av lys til netthinnen og dens fotoreseptorer1. I denne forbindelse er en relativ tilstand av dehydrering avgjørende for å holde kollagenfibrene i hornhinnen stroma riktig justert. Denne homeostase opprettholdes av hornhinnen endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotelet er det innerste hornhinnenlaget. Den har en viktig barriere og pumpefunksjon, som er avgjørende for hornhinnens gjennomsiktighet3. I motsetning til epitelet er epitelet ikke i stand til å fornye4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaket av sykdom eller traumer de gjenværende endotelcellene til å forstørre og migrere, for å dekke resulterende defekter og for å opprettholde hornhinnefunksjonalitet5. Men hvis CEC tetthet faller under en kritisk terskel, dekompensasjon av endotelet fører til et ødem, noe som resulterer i tåkesyn og ubehag eller til og med alvorlig smerte4. Til tross for tilgjengeligheten av legemidler for å lindre symptomer, er for tiden den eneste definitive behandlingen i disse tilfellene hornhinnetransplantasjon, som kan utføres i form av en fulltykkelsestransplantat eller en lamellær endoteltransplantasjon. Sistnevnte prosedyre er tilgjengelig som Descemets membran endotelkeratoplastikk (DMEK) samt Descemets stripping automatisert endotelkeratoplasty (DSAEK)6. Men, beskyttelse av gjenværende CEC og forbedre deres overlevelse kan være et alternativt mål, som trenger en tilstrekkelig sykdommodell for å teste potensielle terapeutiske legemidler.
Nåværende CEC tap sykdom modeller fokus på ødeleggelse av endotelet gjennom injeksjon av giftige midler (f.eks benzalkonium klorid) inn i fremre kammeret eller ved mekanisk slitasje av cellene ved hjelp av en invasiv descemetorhexis teknikk7,8. Mens disse modellene er godt etablert, finnes ulemper som generell inflammatorisk respons og upresis sivile skader. Derfor er disse modellene mer sannsynlig å representere sluttstadier av sykdommen, når de ovennevnte kirurgiske alternativene er uunngåelige.
Med fremskritt i cellulære behandlingsstrategier som stamceller og genterapi, kan anvendelsen av disse cellulære terapiene være nyttig i tidlige stadier av CEC-tap9. Deretter trenger vi en modell som representerer disse tidligere stadiene av sykdommen mer tilstrekkelig. I denne forbindelse har cellekulturmodeller forbedret seg i løpet av det siste tiåret, men er fortsatt begrenset i deres gyldighet, da celler in vitro ikke kan komme i nærheten av å replikere de komplekse interaksjonene som oppstår mellom de forskjellige celletypene i hornhinnen10. Derfor er ex vivo og in vivo sykdomsmodeller fortsatt i høy etterspørsel og forbedrer de eksisterende er av største interesse.
Ikke-invasiv, intraokulær kirurgi ved fotoavbrudd ved hjelp av en neodym: YAG (Nd:YAG) laser har blitt en rutinemessig prosedyre for øyeleger over hele verden siden introduksjonen på slutten av 1970-tallet11. Photodisruption er avhengig av ikke-lineær lysabsorpsjon som fører til dannelse av plasma, generering av akustiske sjokkbølger og opprettelse av kavitasjonsbobler, når applikasjonsstedet ligger i et flytende miljø12. Generelt bidrar disse prosessene til den tiltenkte effekten av presis vevsskjæring. Men, de kan også være kilden til unødvendigsikkerhet skade begrense den lokale innesperring av laser kirurgi13.
Prediksjonen av resulterende mekaniske effekter har betydelig forbedret seg gjennom karakterisering av sjokkbølgeforplantningog kavitasjonskurs. Det er vårt mål å målrette CEC med så lite skade på omkringliggende vev som mulig for å gi en ikke-invasiv, laserassistert eksperimentell sykdomsmodell for de tidlige stadiene av CEC-tap. For dette formålet er det nødvendig å bestemme optimalpulsenergier og posisjoner av brennviddene på laseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultatene av denne pilotstudien indikerer at en Nd:YAG laser kan brukes til å selektivt ablate hornhinne endotelceller når passende parametere for energidose og fokuspunktposisjon velges.
Siden endotelfunksjonen er viktig for hornhinnens gjennomsiktighet og sikring av hornhinnen mot stromal ødem, spiller modeller av endoteldysfunksjon en viktig rolle i utviklingen av anti-edematøse legemidler eller kirurgiske prosedyrer. Det er flere etablerte in vitro modeller for å etterligne in vivo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjelp med eksperimentelle metoder.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
Riferimenti
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal – American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
