Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Abstract

Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.

Introduction

A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores¹. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)². O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea³. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar⁴. Portanto, qualquer dano celular causado por doença ou trauma estimula as células endoteliais remanescentes a aumentar e migrar, para cobrir defeitos resultantes e manter a funcionalidade da córnea⁵. No entanto, se a densidade do CEC cair abaixo de um limiar crítico, a descompensação do endotélio leva a um edema, resultando em visão turva e desconforto ou até mesmo dor severa⁴. Apesar da disponibilidade de medicamentos para aliviar os sintomas, atualmente o único tratamento definitivo nesses casos é o transplante de córnea, que pode ser realizado na forma de enxerto de espessura total ou transplante endotelial lamellar. Este último procedimento está disponível como a ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet (DMEK), bem como a ceratoplastia automatizada de descascamento de Descemet (DSAEK)⁶. No entanto, a proteção da CEC remanescente e o aumento de sua sobrevivência podem ser um alvo alternativo, que precisa de um modelo de doença adequado para testar possíveis drogas terapêuticas.

Os modelos atuais de doença de perda de CEC concentram-se na destruição do endotélio através da injeção de agentes tóxicos (por exemplo, cloreto de benzalkonium) na câmara anterior ou por abrasão mecânica das células utilizando uma técnica de descemetorhexis invasiva^7,8. Embora esses modelos estejam bem estabelecidos, existem desvantagens como a resposta inflamatória geral e danos colaterais imprecisos. Portanto, esses modelos são mais propensos a representar os estágios finais da doença, quando as opções cirúrgicas acima mencionadas são inevitáveis.

Com os avanços nas estratégias de tratamento celular, como células-tronco e terapia genética, a aplicação dessas terapias celulares poderia ser útil nos estágios iniciais da perda de CEC⁹. Posteriormente, precisamos de um modelo que represente esses estágios iniciais da doença de forma mais adequada. Nesse sentido, os modelos de cultura celular melhoraram na última década, mas ainda são limitados em sua validade, pois as células in vitro não podem chegar perto de replicar as interações complexas que ocorrem entre os diferentes tipos de células dentro da córnea¹⁰. Portanto, os modelos de doenças ex vivo e in vivo ainda estão em alta demanda e melhorar os existentes é de extremo interesse.

A cirurgia intraocular não invasiva por fotodisrupção usando um laser neodímio:YAG (Nd:YAG) tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas em todo o mundo desde sua introdução no final da década de 1970¹¹. A fotointerrupção depende da absorção de luz não linear que leva à formação de plasma, geração de ondas de choque acústicas e criação de bolhas de cavitação, sempre que o local de aplicação estiver localizado em um ambiente líquido¹². Em geral, esses processos contribuem para o efeito pretendido do corte preciso do tecido. No entanto, eles também podem ser a fonte de danos colaterais desnecessários que limitam o confinamento local da cirurgia a laser¹³.

A previsão de efeitos mecânicos resultantes melhorou significativamente através da caracterização do curso de propagação e cavitação da onda de choque. Nosso objetivo é atingir a CEC com o mínimo de dano possível ao tecido circundante para fornecer um modelo de doença experimental não invasiva, assistida a laser para os estágios iniciais da perda de CEC. Para isso, é necessário determinar as energias e posições de pulso ideais dos pontos focais do laser.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local. 1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio co…

Representative Results

Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21). Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloraç?…

Discussion

Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.

Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedime…

Materials

BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel