Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para separar las células endoteliales corneales (CEC) de la membrana de Descemet (DM) utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) como modelo de enfermedad ex vivo para la queratopatía bullosa (BK).

Abstract

Los láseres Nd:YAG se han utilizado para realizar cirugía intraocular no invasiva, como la capsulotomía desde hace varias décadas. El efecto incisivo se basa en la descomposición óptica en el foco láser. Se generan ondas de choque acústicas y burbujas de cavitación, causando ruptura del tejido. Los tamaños de burbuja y las amplitudes de presión varían con la energía del pulso y la posición del punto focal. En este estudio, los ojos porcinos enucleados se colocaron frente a un láser Nd:YAG disponible comercialmente. Se probaron las energías de pulso variables, así como las diferentes posiciones de los puntos focales posteriores a la córnea. Las lesiones resultantes fueron evaluadas por microscopía de dos fotones e histología para determinar los mejores parámetros para un desprendimiento exclusivo de células endoteliales corneales (CEC) con un daño colateral mínimo. Las ventajas de este método son la ablación precisa de la CEC, la reducción de los daños colaterales y, sobre todo, el tratamiento sin contacto.

Introduction

La transparencia de la córnea es esencial para la transmisión de la luz a la retina y sus fotorreceptores¹. En este sentido, un estado relativo de deshidratación es fundamental para mantener las fibras de colágeno dentro del estroma corneal correctamente alineados. Esta homeostasis es mantenida por células endoteliales corneales (CEC) ubicadas en la membrana del Descemet (DM)². El endotelio es la capa corneal más interna. Tiene una importante función de barrera y bomba, que es crucial para la transparencia corneal³. A diferencia del epitelio, el endotelio no es capaz de renovarse a^{sí mismo 4}. Por lo tanto, cualquier daño celular causado por enfermedad o trauma estimula las células endoteliales restantes para agrandar y migrar, para cubrir los defectos resultantes y para mantener la funcionalidad corneal⁵. Sin embargo, si la densidad CEC cae por debajo de un umbral crítico, la descompensación del endotelio conduce a un edema, lo que resulta en visión borrosa y malestar o incluso dolor intenso⁴. A pesar de la disponibilidad de fármacos para aliviar los síntomas, actualmente el único tratamiento definitivo en estos casos es el trasplante de córnea, que se puede realizar en forma de un injerto de espesor completo o un trasplante endotelial lamelar. Este último procedimiento está disponible como queratoplastia endotelial de membrana (DMEK) de Descemet, así como como queratoplastia endotelial automatizada de Descemet (DSAEK)⁶. Sin embargo, la protección de la CEC restante y la mejora de su supervivencia podrían ser un objetivo alternativo, que necesita un modelo adecuado de enfermedad para probar posibles medicamentos terapéuticos.

Los modelos actuales de enfermedad por pérdida de CEC se centran en la destrucción del endotelio mediante la inyección de agentes tóxicos (por ejemplo, cloruro de benzalconio) en la cámara anterior o por abrasión mecánica de las células mediante una técnica invasiva dedescemetorhexis^7,8. Si bien estos modelos están bien establecidos, existen desventajas como la respuesta inflamatoria general y los daños colaterales imprecisos. Por lo tanto, estos modelos son más propensos a representar las etapas finales de la enfermedad, cuando las opciones quirúrgicas antes mencionadas son inevitables.

Con los avances en las estrategias de tratamiento celular como las células madre y la terapia génica, la aplicación de estas terapias celulares podría ser útil en las primeras etapas de la pérdida de CEC⁹. Posteriormente, necesitamos un modelo que represente estas etapas tempranas de la enfermedad de manera más adecuada. En este sentido, los modelos de cultivo celular han mejorado en la última década, pero todavía están limitados en su validez, ya que las células in vitro no pueden acercarse a replicar las complejas interacciones que se producen entre los diferentes tipos de células dentro de la córnea^10. Por lo tanto, los modelos de enfermedad ex vivo e in vivo siguen siendo muy demandados y mejorar los existentes es de suma interés.

La cirugía intraocular no invasiva por fotodisfial utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) se ha convertido en un procedimiento de rutina para oftalmólogos de todo el mundo desde su introducción a finales de la década de 1970^11. La fotorinterrupción se basa en la absorción de luz no lineal que conduce a la formación de plasma, generación de ondas de choque acústicas y creación de burbujas de cavitación, siempre que el sitio de aplicación se encuentra en un entorno líquido^12. En general, estos procesos contribuyen al efecto previsto del corte preciso de tejidos. Sin embargo, también pueden ser la fuente de daños colaterales innecesarios que limitan el confinamiento local de la cirugía láser^13.

La predicción de los efectos mecánicos resultantes ha mejorado significativamente a través de la caracterización del curso de propagación de ondas de choque y cavitación. Nuestro objetivo es atacar la CEC con el menor daño posible al tejido circundante para proporcionar un modelo de enfermedad experimental no invasiva, asistida por láser para las primeras etapas de la pérdida de CEC. Para ello, es necesario determinar las energías óptimas del pulso y las posiciones de los puntos focales del láser.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con el tejido animal siguen las directrices del Comité local de cuidado y ética de los animales. 1. Preparación del cultivo de órganos y tratamiento con láser Obtenga ojos porcinos recién enucledados del matadero local. Manténgalos frescos (4oC) en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, complementado con L-glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina (1%), y suero porcino (10%), a partir de ahora mencion…

Representative Results

Usando el procedimiento presentado aquí, tratamos los ojos con un láser Nd:YAG, evaluando diferentes energías de pulso (1.0-4.6 mJ) y posiciones de los puntos focales (distancia de la superficie posterior de la córnea: 0.0-0.2 mm) para encontrar los parámetros óptimos. Se evaluaron múltiples réplicas (n x 3) para cada constelación de los parámetros láser (12 x 21). Además del protocolo antes mencionado, la muestra fue analizada con un microscopio de dos fotones antes de la fijació…

Discussion

Los resultados de este estudio piloto indican que un láser Nd:YAG se puede utilizar para ablar selectivamente las células endoteliales corneales cuando se eligen los parámetros adecuados para la dosis de energía y la posición del punto de enfoque.

Como la función endotelial es importante para la transparencia corneal y la protección de la córnea del edema estromales, los modelos de disfunción endotelial juegan un papel importante en el desarrollo de fármacos antiedematosos o procedim…

Materials

BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel