Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.
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Articolo metodologico
Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell'ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L'infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l'artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall'estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L'esperimento della sacca d'aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell'artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.
Introduzione
I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell'intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l'infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono ....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dall'Università di Pechino di Medicina Cinese Animal Care and Use Committee.
NOTA: sono stati utilizzati topi C57BL/6 (7-8 settimane).
1. Isolamento neutrofilo
- Acquisizione di cellule essudati peritoneali
- Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi.
NOTA: Impostare il numero di mouse come N, (2N- 1) mL di soluzione deve essere dissolto e filtrato in anticipo. - Spruzzare lo spazio di lavoro con 70% di etanolo. Utilizzare un iniettore di insu....
- Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi.
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Risultati
Le cellule di essutazione peritoneale sono state raccolte dal liquido di lavaggio dei topi. Le celle sono state risospese in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo, sovrapposte a due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua (Figura 1A) e centrifugate a 1.500 x g per 30 min. Neutrophils (-95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono state recuperate dall'interfaccia inferiore (Figura 1B
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Discussione
Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.
Abbiamo usato l'esperimento della sacca d'aria per esplorare l'infiltrazione indotta da LPS dei neut.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell'Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).
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Materiali
2
Beijing Miscela diMiscela di etanolo al 95% 950 mL di etanolo al 100% con 50 mL di dHO Soluzione di differenziazione superveloce dell'alcol Beyotime C0165S ANTICORPI Anti-mieloperossidasi Anticorpo Abcam di permeabilizzazione soluzione della sacca d'aria
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione Fast Green allo 0,1% | Solarbio | 8348b | Trasferire 20 mg di grane veloce FCF in un flaconcino in un altro becher da 100 mL. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione verde rapida allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES 75mm |
| 0,1% Safranin O Soluzione colorante | Solarbio | 8348a | Trasferire 20 mg di colorante di safranina O in una fiala in un becher da 100 ml. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione colorante di safranina O allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES da 75 mm |
| Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 0,5 M, pH 8,0 | Sigma | 324506 | sterile |
| 100% etanolo | Beijing Chemical Works | ||
| 100% metanolo | Chemical Works | ||
| Provetta da centrifuga in polipropilene conico da 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Ago | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Ago | BD | 305110 | |
| 3% albumina sierica bovina (BSA) | Sciogliere 0,3 g di BSA in 10 mL di PBS | ||
| 3% H2O2 | Miscelare 1 mL 30% H2O2 con metanolo con 9 mL di metanolo | ||
| 3,3'-diaminobenzidina (DAB) | kit ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Ago | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| Siringa da 5 mL | BD | Z683574 | |
| Provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 mL | Falcon | 14-432-22 | |
| etanolo al 50% 500 mL di etanolo | al 100% con 500 mL di dH2O | ||
| 54,8% di Percoll | Mix 2,74 mL SIP con 2,26 mL 1&volte; PBS, da fermo | ||
| 70% Miscela di etanolo | 700 mL 100% etanolo con 300 mL dH2O | ||
| 70,2% Percoll | Mix 3,51 mL SIP con 1,49 mL 1&volte; PBS, da fermo | ||
| Miscela di etanolo all'80% | 800 mL di etanolo al 100% con 200 mL di dH2O | ||
| ab208670 | |||
| Anticorpo anti-neutrofili elastasi | Abcam | ab21595 | |
| Analizzatore ematologico automatico | Sysmex | XS-800i | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Adiuvante completo di Freund, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Vetrino coprioggetto | CITOGLAS | 10212432C | |
| Misuratore di spessore a quadrante | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1,5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Siero bovino fetale (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Sistema di anestesia gassosa | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| IgG anti-coniglio di capra H& L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | Questo è l'anticorpo secondario utilizzato nella colorazione immunoistochimica. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israele | 02-016-1A | Soluzione sterile |
| per colorazione con ematossilina | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA E INTEGRATORI | |||
| Safranin modificata O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillina Streptomicina soluzione, 100&volte; | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Gradiente di densità medio |
| Miscela tampone | 100 μ L Triton X-100 con 1 L dH2O per ottenere lo 0,01% di | ||
| soluzione salina tampone fosfato Triton X-100 (PBS), 1&volte; | Miscelare 90% ddH2O con 10% (v/v) 10&volte; PBS, | ||
| salina tampone fosfato autoclavato (PBS), 10&volte; | Sciogliere 16 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 2,88 g di Na2HPO4· 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anidro) in 200 mL ddH2O, regolare pH 7,4, autoclavato | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteoso Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Buffer | di recuperoMiscelare 18 mL di tampone di recupero A con 82 mL di tampone di recupero B, aggiungere dH2O a 1000 mL, regolare il pH a 6,0 | ||
| Tampone di recupero A Stock per IHC | Sciogliere 4,2 g di acido citrico (C6H5O7· H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Tampone di recupero B Stock per IHC | Sciogliere 5,88 g di citrato trisodico diidrato (C6H5Na3O7· 2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium è integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina. | ||
| Shu Rui U40 Ago per iniezione di insulina sterile monouso 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUZIONE | |||
| Acido acido corto (SIP) | Mescolare il 90% (v/v) di percoll con il 10% (v/v) 10× PBS, rimanere fermi per 20 minuti | ||
| Tampone di lavaggio nel saggio | Diluire da 0,5 M EDTA a 10 mM con HBSS | ||
| Xilene | Beijing Chemical Works |
Riferimenti
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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Ristampe e permessi
