कीमोटैक्टिक और मानव न्यूट्रोफिल झुंड के आणविक विश्लेषण के लिए बायोपार्टिकल माइक्रोरेज़ विट्रो में झुंड
Summary
यह प्रोटोकॉल बायोपार्टिकल माइक्रोरे उत्पन्न करता है जो स्थानिक रूप से नियंत्रित न्यूट्रोफिल झुंड प्रदान करते हैं। यह मध्यस्थों तक आसान पहुंच प्रदान करता है जो माइग्रेशन के दौरान न्यूट्रोफिल जारी करते हैं और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
Abstract
न्यूट्रोफिल झुंड एक सहकारी प्रक्रिया है जिसके द्वारा न्यूट्रोफिल संक्रमण की एक साइट को सील करते हैं और ऊतक पुनर्गठन को बढ़ावा देते हैं। झुंड शास्त्रीय पशु कोशिका प्रवास के विशेषता पैटर्न दिखा मॉडल में वीवो में अध्ययन किया गया है । हालांकि, वीवो मॉडल में कई सीमाएं हैं, जिनमें इंटरकोशियलर मध्यस्थ शामिल हैं जो उपयोग और विश्लेषण करने में मुश्किल हैं, साथ ही मानव न्यूट्रोफिल का सीधे विश्लेषण करने में असमर्थता भी शामिल है। इन सीमाओं के कारण, एक इन विट्रो प्लेटफॉर्म की आवश्यकता होती है जो मानव न्यूट्रोफिल के साथ झुंड का अध्ययन करता है और झुंड के दौरान उत्पन्न आणविक संकेतों तक आसान पहुंच प्रदान करता है। यहां, एक मल्टीस्टेप माइक्रोस्टैंपिंग प्रक्रिया का उपयोग बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरी उत्पन्न करने के लिए किया जाता है जो वीवो संक्रमण में नकल करके झुंड को उत्तेजित करता है। बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरे न्यूट्रोफिल को नियंत्रित और स्थिर तरीके से झुंड में लाती है। माइक्रोसरणी पर, न्यूट्रोफिल गति में वृद्धि और बायोपार्टिकल समूहों के आसपास स्थिर झुंड के रूप में । इसके अतिरिक्त, न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पन्न अलौकिक का विश्लेषण किया गया था और 16 प्रोटीन ों को झुंड के दौरान अलग ढंग से व्यक्त किया गया था। यह इन विट्रो झुंड मंच न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और प्रोटीन रिलीज के प्रत्यक्ष विश्लेषण को प्रजनन योग्य, स्थानिक रूप से नियंत्रित तरीके से प्रदान करता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल, रक्तप्रवाह 1में सबसे प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका, संभावित नैदानिक और चिकित्सीय लक्ष्य2,3 के रूप में ध्यान प्राप्त कर रहे हैंक्योंकिवे गाउट4,सेप्सिस3,आघात5,6,कैंसर1,7,8,और विभिन्न ऑटोइम्यून रोगों सहित विभिन्न चिकित्सा स्थितियों में शामिल हो सकते हैं5,9। न्यूट्रोफिल झुंड एक बहुमंचीय, कसकर विनियमित प्रक्रिया है जिसमें जटिलता है जो इसे अध्ययन5,10,11का विशेष रूप से दिलचस्प ध्यान देती है। झुंड के दौरान, न्यूट्रोफिल आसपास के स्वस्थ ऊतक5,10,11से सूजन की एक साइट को अलग करते हैं। घाव भरने को बढ़ावा देने के लिए न्यूट्रोफिल झुंड का उचित नियमन आवश्यक है और अंततः सूजन संकल्प5,12। न्यूट्रोफिल झुंड मुख्य रूप से कृंतक12,13,14,15 और जेब्राफिश10,11,12,15 मॉडलों में वीवो में अध्ययन किया गया है। हालांकि, वीवो पशु मॉडल में इन की प्रकृति सीमाओं को जन्म देती है5। उदाहरण के लिए, झुंड के दौरान न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मध्यस्थों विश्लेषण5के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं । इसके अतिरिक्त, वीवो में किसी दिए गए मध्यस्थ के लिए कई संभावित स्रोत हैं, इसलिए वीवो प्रयोग में एक आनुवंशिक कमी को सेलुलर उत्पादन और/या बातचीत को बाधित करने के लिए एक निश्चित प्रक्रिया13में उस मध्यस्थ की भूमिका की जांच करने के लिए शुरू करना चाहिए । एक इन विट्रो प्रयोग अतिरिक्त कोशिकाओं के संदर्भ के बिना न्यूट्रोफिल अवलोकन को सक्षम करके इस जटिलता को दरकिनार करता है। इसके अतिरिक्त, मानव न्यूट्रोफिल समन्वित प्रवास का वर्णन अनुसंधान सीमित16है । एक इन विट्रो झुंड मंच पर, मानव न्यूट्रोफिल का सीधा विश्लेषण किया जा सकता है। एक इन विट्रो झुंड मंच वीवो अध्ययन में की सीमाओं से छोड़ दिया अंतराल को भरने के अवसर प्रदान करके वीवो अध्ययन में से प्राप्त ज्ञान पर विस्तार कर सकता है ।
वीवो न्यूट्रोफिल झुंड में नकल करने वाले इन विट्रो प्लेटफॉर्म की आवश्यकता को दूर करने के लिए, हमने एक माइक्रोस्टैंपिंग प्लेटफॉर्म विकसित किया जो हमें बायोपार्टिकल माइक्रोरे पैटर्न करने में सक्षम बनाता है जो एक स्थानिक रूप से नियंत्रित तरीके से न्यूट्रीफिल को उत्तेजित करता है। हम दो चरण की प्रक्रिया में ग्लास स्लाइड पर बायोपार्टिकल माइक्रोरे उत्पन्न करते हैं। सबसे पहले, हम सीनिक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट (सीपी) स्पॉट की माइक्रोसरणी उत्पन्न करने के लिए माइक्रोस्टैंपिंग का उपयोग करते हैं। दूसरा, हम बायोकणों का एक समाधान जोड़ते हैं जो इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से सीपी स्पॉट का पालन करते हैं। पहले सीपी परत पैटर्निंग करके, हम चुनिंदा रूप से वांछित न्यूट्रोफिल झुंड पैटर्न उत्पन्न करने के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बायोकणों को पैटर्न कर सकते हैं। सकारात्मक रूप से आवेशित परत जोरदार धुलाई कदम के माध्यम से नकारात्मक रूप से आवेशित बायोकणरखती है जो ग्लास स्लाइड पर उन क्षेत्रों से बायोकणों को हटा देती है जिनमें सीपी नहीं है। इसके अतिरिक्त, सीपी यहां इस्तेमाल किया जाता है, एक्रिलामाइड और क्वार्नेइज्ड कॉशनिक मोनोमर का एक कोपॉलीमर बायोसंगत है, इसलिए यह न्यूट्रोफिल ्स से प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करता है। इसमें एक बहुत ही उच्च सतह आवेश है जो माइक्रोन के आकार के बायोकणों को ग्लास स्लाइड में स्थिर करता है, इस प्रकार ग्लास स्लाइड पर नमूनों की स्थिति से कणों को हटाने से न्यूट्रोफिल को बाधित करता है। इसके परिणामस्वरूप माइक्रोएरे में व्यवस्थित बायोपार्टिकल क्लस्टर होते हैं। जब हमने माइक्रोव्यूरी में न्यूट्रोफिल जोड़े, तो उन्होंने बायोपार्टिकल क्लस्टर के चारों ओर स्थिर झुंड बनाए। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पर नज़र रखने के माध्यम से, हमने पाया कि झुंड न्यूट्रोफिल सक्रिय रूप से बायोपार्टिकल समूहों की ओर प्रवास करते हैं। इसके अलावा, हमने झुंड के दौरान न्यूट्रोफिल जारी करने वाले कुछ मध्यस्थों का विश्लेषण करने के लिए इस मंच का उपयोग किया। हमें 16 मध्यस्थ मिले जो झुंड के दौरान अलग ढंग से व्यक्त किए जाते हैं। उनकी सांद्रता समय के साथ तीन सामान्य रुझानों का पालन करती है: वृद्धि, कमी या स्पाइक। हमारे इन विट्रो न्यूट्रोफिल झुंड मंच स्थानिक नियंत्रित मानव न्यूट्रोफिल झुंड के विश्लेषण की सुविधा, साथ ही संग्रह और न्यूट्रोफिल झुंड द्वारा जारी मध्यस्थों के विश्लेषण । पिछले प्रकाशन में, हमने दिखादिया कि कुछ चिकित्सा स्थितियों (आघात, ऑटोइम्यून रोग और सेप्सिस) वाले रोगियों में न्यूट्रोफिल थे जो स्वस्थ दानदाताओं5से अलग कार्य करते थे। भविष्य के शोध अध्ययनों में, हमारे मंच का उपयोग विभिन्न प्रकार की रोगी आबादी के बीच न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह मंच मात्रात्मक रूप से न्यूट्रोफिल झुंड में शामिल जटिल समन्वय का विश्लेषण कर सकता है। एक विशिष्ट रोगी आबादी के न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन या ब्याज के रोगजनक के लिए न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन किए जा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने इन विट्रो न्यूट्रोफिल झुंड को उत्तेजित करने के लिए बायोकणों की एक समान सरणी उत्पन्न करने के लिए एक माइक्रोस्टैंपिंग मंच विकसित किया। हमारे मंच की इन विट्रो प्रकृति हमें विवो झुंड प्रयोगों में उ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को विलियम जी लोरी डिपार्टमेंट ऑफ केमिकल एंड बायोमॉलिक्यूलर इंजीनियरिंग और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर से फंडिंग से सपोर्ट किया गया था । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत डेटा परिसर माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा, ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में उपलब्ध Imaris x64 (ver. ९.३.० बिटप्लेन) का उपयोग कर संसाधित छवियों से आया था । यह सुविधा अनुदान पी 30 सीए016058, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा, एमडी द्वारा समर्थित है।
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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