Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro
Summary
Ce protocole génère des microréseaux de bioparticules qui fournissent un essaim de neutrophile contrôlé spatialement. Il permet un accès facile aux médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant la migration et permet une analyse d’imagerie quantitative.
Abstract
L’essaimage de neutrophile est un processus coopératif par lequel les neutrophiles scellent un site d’infection et favorisent la réorganisation des tissus. L’essaimage a été classiquement étudiée in vivo dans des modèles animaux montrant des modèles caractéristiques de migration cellulaire. Cependant, les modèles in vivo ont plusieurs limites, y compris les médiateurs intercellulaires qui sont difficiles d’accès et d’analyse, ainsi que l’incapacité d’analyser directement les neutrophiles humains. En raison de ces limitations, il est nécessaire d’avoir une plate-forme in vitro qui étudie le grouillage de neutrophiles humains et facilite l’accès aux signaux moléculaires générés pendant l’essaimage. Ici, un processus de micro-amactinage en plusieurs étapes est utilisé pour générer un microréseau de bioparticules qui stimule l’essaimage en imitant une infection in vivo. Le microarray de bioparticules induit des neutrophiles à essaimer d’une manière contrôlée et stable. Sur le microarray, les neutrophiles augmentent en vitesse et forment des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En outre, le supernatant généré par les neutrophiles a été analysé et 16 protéines ont été découvertes pour avoir été exprimées différemment au cours de l’essaimage. Cette plate-forme d’essaimage in vitro facilite l’analyse directe de la migration des neutrophiles et de la libération de protéines d’une manière reproductible et contrôlée spatialement.
Introduction
Neutrophiles, le globule blanc le plus abondant dans la circulation sanguine1, attirent l’attention en tant que cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles2,3 parce qu’ils peuvent être impliqués dans une variété de conditions médicales, y compris la goutte4, sepsis3, traumatisme5,6, cancer1,7,8, et diverses maladies auto-immunes5,9. Neutrophil essaimage est un processus en plusieurs étapes, étroitement réglementé avec une complexité qui en fait un centre particulièrement intéressant de l’étude5,10,11. Pendant l’essaimage, les neutrophiles isolent un site d’inflammation du tissu sain environnant5,10,11. Une réglementation appropriée de l’essaimage neutrophile est essentielle pour promouvoir la cicatrisation des plaies et, finalement, la résolution de l’inflammation5,12. Neutrophil essaimage a principalement été étudié in vivo chez les rongeurs12,13,14,15 et le poisson zèbre10,11,12,15 modèles. Cependant, la nature de ces modèles animaux in vivo donne lieu à des limitations5. Par exemple, les médiateurs libérés par les neutrophiles pendant l’essaimage ne sont pas facilement accessibles pour l’analyse5. En outre, il existe de nombreuses sources potentielles pour un médiateur donné in vivo, de sorte qu’une expérience in vivo doit introduire une déficience génétique pour inhiber la production cellulaire et / ou l’interaction afin d’étudier le rôle de ce médiateur dans un processus donné13. Une expérience in vitro contourne cette complication en permettant l’observation des neutrophiles sans le contexte de cellules supplémentaires. En outre, la recherche décrivant la migration coordonnée des neutrophiles humains est limitée16. Sur une plate-forme d’essaimage in vitro, les neutrophiles humains peuvent être analysés directement. Une plate-forme d’essaimage in vitro pourrait élargir les connaissances acquises à partir d’études in vivo en offrant des possibilités de combler les lacunes laissées par les limites des études in vivo.
Pour répondre à la nécessité d’une plate-forme in vitro qui imite l’essaimage in vivo neutrophile, nous avons développé une plate-forme de micro-estampillage qui nous permet de modeler des microréseaux de bioparticules qui stimulent l’essaimage de neutrophiles d’une manière contrôlée spatialement. Nous produisons des microréseaux de bioparticules sur des lames de verre en deux étapes. Tout d’abord, nous utilisons le micro-estampage pour générer un microarray de taches de polyélectrolyte cationique (CP). Deuxièmement, nous ajoutons une solution de bioparticules qui adhèrent aux taches de CP par l’interaction électrostatique. En modelant d’abord la couche de CP, nous pouvons modeler sélectivement les bioparticules chargées négativement pour produire le modèle d’essaimage désiré de neutrophile. La couche chargée positivement retient les bioparticules chargées négativement par l’étape de lavage vigoureuse qui enlève les bioparticules des secteurs sur la glissière de verre qui n’ont pas le CP. En outre, le CP utilisé ici, un copolymère d’acrylamide et de monomère cationique quatertisée, est biocompatible, de sorte qu’il n’induit pas une réponse des neutrophiles. Il a une charge de surface très élevée qui immobilise les bioparticules de la taille d’un micron à la glissière de verre, empêchant ainsi les neutrophiles d’enlever les particules de la position modelée sur la glissière de verre. Il en résulte des grappes de bioparticules disposées en microarray. Lorsque nous avons ajouté des neutrophiles au microréseau, ils ont formé des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En suivant la migration des neutrophiles, nous avons constaté que les neutrophiles grouillants migrent activement vers les grappes de bioparticules. En outre, nous avons utilisé cette plate-forme pour analyser certains médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant l’essaimage. Nous avons trouvé 16 médiateurs qui sont exprimés différemment pendant l’essaimage. Leurs concentrations suivent trois tendances générales au fil du temps : augmentation, diminution ou pic. Notre plate-forme d’essaimage in vitro neutrophile facilite l’analyse de l’essaimage de neutrophiles humains contrôlés spatialement, ainsi que la collecte et l’analyse des médiateurs libérés par l’essaimage neutrophile. Dans une publication précédente, nous avons démontré que les patients présentant certaines conditions médicales (traumatisme, maladie auto-immune, et sepsis), ont eu des neutrophiles qui ont fonctionné différemment de ceux des donateurs en bonne santé5. Dans de futures études de recherche, notre plate-forme pourrait être utilisée pour analyser la fonction neutrophile parmi une variété de populations de patients. Cette plate-forme peut analyser quantitativement la coordination complexe impliquée dans l’essaimage de neutrophiles. D’autres études peuvent être faites pour fournir un aperçu sur la fonction neutrophile d’une population spécifique de patients ou la réponse de neutrophile à un agent pathogène d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une plate-forme de micro-ampillage pour générer des réseaux uniformes de bioparticules pour stimuler l’essaimage in vitro de neutrophiles. La nature in vitro de notre plate-forme nous permet de contourner les complications qui surgissent avec les expériences d’essaimage in vivo, à savoir la faible capacité d’analyser les médiateurs libérés par les neutrophiles grouillant s’agitent5. En outre, les modèles in vivo sont généralement effectués chez les ronge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le financement du Département William G. Lowrie de génie chimique et biomoléculaire et du Comprehensive Cancer Center de l’Ohio State University. Les données présentées dans ce rapport proviennent d’images traitées à l’aide d’Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles à l’installation de microscopie et d’imagerie du campus de l’Université d’État de l’Ohio. Cette installation est soutenue en partie par la subvention P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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