मानव प्रेरित प्लीस्ट्रेटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मिटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया
Summary
बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में शामिल हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन्स का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल एक्सोन और उनकी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के साथ माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के अध्ययन को सुविधाजनक बनाएगा।
Abstract
न्यूरॉन्स उच्च ऊर्जा के लिए तीव्र मांग है ताकि उनके कार्यों का समर्थन करने के लिए । मानव न्यूरॉन्स में एक्सोन के साथ बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन देखा गया है, जो विभिन्न रोग राज्यों में न्यूरोडिजेनरेशन में योगदान दे सकता है। यद्यपि जीवित मानव नसों में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की जांच करना चुनौतीपूर्ण है, लेकिन न्यूरोडिजेनरेशन में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए ऐसे प्रतिमान महत्वपूर्ण हैं। यहां वर्णित मानव प्रेरित प्लुरीटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से प्राप्त फोरब्रेन न्यूरॉन एक्सॉन में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। आईपीएससी को अच्छी तरह से स्थापित तरीकों का उपयोग करके टेलेएंसेफेलिक ग्लूटाएर्गिक न्यूरॉन्स में विभेदित किया जाता है। न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोट्रैकर सीएमएक्सआरओ से दाग दिया जाता है, और एक्सॉन के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन को सेल संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर से लैस लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है। समय-चूक छवियों का विश्लेषण “मल्टीकिमोग्राफ”, “बायोफॉर्मेट आयातक”, और “मैक्रो” प्लगइन्स के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन के केमोग्राफ उत्पन्न होते हैं, और एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में औसत माइटोकॉन्ड्रियल वेग कायोग्राफ से पढ़ा जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान विश्लेषण के बारे में, इमेजजे का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई, क्षेत्र और पहलू अनुपात प्राप्त किए जाते हैं। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए एक्सॉन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी और उनकी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और वितरण ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स में चर और विशेष ऊर्जावान मांगों को पूरा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरॉन्स सिनेप्स के गठन के माध्यम से लक्ष्यों के साथ जुड़ने के लिए बेहद लंबे अक्षों का विस्तार कर सकते हैं, जो सीए2 + बफरिंग और आयन धाराओं के लिए ऊर्जा के उच्च स्तर की मांग करते हैं। न्यूरॉन्स के एक्सोनल और सिनैप्टिक फ़ंक्शन का समर्थन करने के लिए सोमा से एक्सॉन तक माइटोकॉन्ड्रिया का परिवहन महत्वपूर्ण है। स्थानिक और अस्थायी गतिशील माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन तेजी से एक्सोनल परिवहन द्वारा कई माइक्रोमीटर प्रति सेकंड1की दरों पर आयोजित किया जाता है ।
विशेष रूप से, मोटर या एडाप्टर प्रोटीन, जैसे किनेसिन और डिनेइन, माइटोकॉन्ड्रिया2,3के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोट्यूब्यूल के साथ फास्ट ऑर्गेनेल परिवहन में भाग लेते हैं। सामान्य न्यूरोनल गतिविधि के लिए न्यूरोनल सोमा से डिस्टल एक्सॉन (एंट्रोग्रेड एक्सोन लांचे) तक नए इकट्ठे माइटोकॉन्ड्रिया के उचित परिवहन और डिस्टल एक्सॉन से माइटोकॉन्ड्रिया के रिवर्स परिवहन को सेल बॉडी (प्रतिगामी परिवहन) तक वापस करने की आवश्यकता होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि अनुचित माइटोकॉन्ड्रियल आवंटन न्यूरोनल दोषों और मोटर न्यूरॉन अपक्षयी रोगों4,5से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है । इसलिए, न्यूरोडिजेनरेशन में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका को विच्छेदन करने के लिए, लाइव संस्कृतियों में अक्षों के साथ माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन की जांच करने के लिए तरीके स्थापित करना महत्वपूर्ण है।
माइटोकॉन्ड्रिया की ट्रैकिंग की जांच और विश्लेषण करने में दो मुख्य चुनौतियां हैं: (1) हर फ्रेम में पृष्ठभूमि से माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करना, और (2) हर फ्रेम के बीच कनेक्शन का विश्लेषण और उत्पादन करना। पहली चुनौती को हल करने में, एक फ्लोरेसेंस लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग पृष्ठभूमि से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है, जैसे माइटोट्रैकर डाये या फ्लोरेसेंस-फ्यूज्ड माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण प्रोटीन (जैसे, माइटो-जीएफपी)6,7,8। फ्रेम के बीच संबंध का विश्लेषण करने के लिए, पिछलेअध्ययनों9 में कई एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर उपकरण वर्णित किए गए हैं। हाल ही में एक पेपर में शोधकर्ताओं ने माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन की मात्रा निर्धारित करने के लिए चार अलग-अलग स्वचालित उपकरणों (जैसे, वोलोसिटी, इमरिस, wrMTrck, और अंतर ट्रैकर) की तुलना की। परिणामों से पता चला है कि ट्रैक लंबाई, माइटोकॉन्ड्रियल विस्थापन, आंदोलन अवधि और वेग में विसंगतियों के बावजूद, ये स्वचालित उपकरणउपचार 10के बाद परिवहन अंतर का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त हैं। इन उपकरणों के अलावा, इमेजजे के लिए एक एकीकृत प्लगइन “मैक्रोन” (रिएटडोर्फ और सेट्ज द्वारा लिखित) का व्यापक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन11का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है। यह विधि केमोग्राफ उत्पन्न करती है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें एंट्रोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में वेग शामिल है।
माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल्स हैं जो शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के जवाब में लगातार संख्या और आकृति विज्ञान में बदलते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और होमोस्टोसिस को कसकर विनियमित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन के बीच असंतुलन बेहद कम या लंबे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को प्रेरित कर सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को ख़राब कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप असामान्य न्यूरोनल गतिविधियां और न्यूरोडिजेनरेशन हो सकते हैं। बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग, और वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया (एचएसपी)12,13,14,15जैसे विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शामिल हैं। एचएसपी विरासत में मिले न्यूरोलॉजिकल विकारों का एक विषम समूह है जो कोर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट के पतन और बाद में निचले अंग की मांसपेशियों को नियंत्रित करने में विफलता की विशेषता है16,17। इस अध्ययन में आईपीएससी से व्युत्पन्न फोरब्रेन न्यूरॉन्स का इस्तेमाल एचएसपी में माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्ट और मॉर्फोलॉजी का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह विधि लाइव संस्कृतियों में न्यूरोनल अक्षों की माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की जांच के लिए एक अनूठा प्रतिमान प्रदान करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख लाल फ्लोरोसेंट डाये और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके न्यूरोनल एक्सोन में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो दोनों न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्पास्टिक पैराप्लेजिया फाउंडेशन, ब्लेजर फाउंडेशन और एनआईएच (R21NS109837) ने समर्थन दिया था।
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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