遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析
Summary
ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。
Abstract
ニューロンは、その機能をサポートするために高エネルギーのための強い要求を持っています。.軸索に沿ったミトコンドリアの輸送がヒトのニューロンで観察され、様々な疾患状態で神経変性に寄与する可能性がある。生きている人間の神経におけるミトコンドリアのダイナミクスを調べることは困難であるが、そのようなパラダイムは神経変性におけるミトコンドリアの役割を研究するために重要である。ここで説明する、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する前脳神経軸索におけるミトコンドリア輸送およびミトコンドリア形態を解析するためのプロトコルである。iPSCは、確立された方法を使用して、テレンスファリックグルタミン酸作動性ニューロンに分化される。ニューロンのミトコンドリアはMitoTracker CMXRosで染色され、軸索内のミトコンドリア運動は細胞培養用インキュベーターを備えた生細胞イメージング顕微鏡を用いて捕捉される。タイムラプス画像は、「マルチキモグラフ」、「バイオフォーマットインポーター」、「マクロ」プラグインを使用してソフトウェアを使用して分析されます。ミトコンドリア輸送のカイモグラフが生成され、前向きおよび逆行方向における平均ミトコンドリア速度がキモグラフから読み取られる。ミトコンドリア形態解析に関しては、ミトコンドリアの長さ、面積、およびアスペクト比がImageJを用いて得られます。要約すると、このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとそれらの形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。
Introduction
ミトコンドリアの運動性と分布は、偏光ニューロンにおける可変および特殊なエネルギッシュな要求を満たす上で重要な役割を果たします。ニューロンは、Ca2+バッファリングとイオン電流に高レベルのエネルギーを必要とするシナプスの形成を通じてターゲットと接続するために非常に長い軸索を拡張することができます。ソマから軸索へのミトコンドリアの輸送は、ニューロンの軸索およびシナプス機能をサポートするために重要です。空間的および時間的に動的なミトコンドリア運動は、毎秒数マイクロメートルの速度で速い軸索輸送によって1.
具体的には、キネシンやダイネインなどのモーターまたはアダプタータンパク質は、ミトコンドリア2,3の動きを制御するために微小管に沿って速いオルガネラ輸送に関与する。正常な神経活動は、新たに組み立てられたミトコンドリアを神経細胞の体から遠位軸(前向き軸索輸送)に適切に輸送し、遠位軸から細胞体に戻ってミトコンドリアを逆輸送する必要があります。.最近の研究では、不適切なミトコンドリアの割り当てが神経細胞欠損および運動ニューロン変性疾患4、5と強く関連することが示されている。したがって、神経変性におけるミトコンドリアの役割を解剖するためには、生きた培養における軸索に沿ったミトコンドリアの動きを調べる方法を確立することが重要である。
ミトコンドリアの追跡を調べて分析する際には、(1)すべてのフレームの背景からミトコンドリアを特定すること、(2)すべてのフレーム間の接続を分析して生成するという2つの主な課題があります。第1の課題を解決する際に、ミトトラッカー色素や蛍光融合ミトコンドリアターゲティングタンパク質(例えば、mito-GFP)6,7,8などのミトコンドリアを背景から区別するために蛍光標識アプローチが広く用いられている。フレーム間の関連性を分析するために、いくつかのアルゴリズムとソフトウェアツールが、以前の研究9で説明されました。最近の論文では、研究者は4つの異なる自動化ツール(例えば、Volocity、イマリス、wrMTrck、および差トラッカー)をミトコンドリア輸送を定量化するために比較しました。その結果、トラック長、ミトコンドリア変位、運動継続時間、および速度の不一致にもかかわらず、これらの自動化ツールは、処理10後の輸送差を評価するのに適していることを示した。これらのツールに加えて、ImageJ用の統合プラグイン「マクロ」(リートドルフとザイツによって書かれた)は、ミトコンドリア輸送11の分析に広く使用されています。この方法は、前向きと逆行方向の両方の速度を含むミトコンドリアの動きを分析するために使用できるキモグラフを生成します。
ミトコンドリアは、生理学的および病理学的状態の両方に応答して、数と形態の絶えず変化する非常にダイナミックなオルガネラです。ミトコンドリアの核分裂と融合は、ミトコンドリアの形態とホメオスタシスをしっかりと調節します。ミトコンドリア核分裂と融合の不均衡は、ミトコンドリアの機能を損ない、神経活動や神経変性の異常をもたらす可能性がある、非常に短いまたは長いミトコンドリアネットワークを誘導することができます。ミトコンドリアの輸送や形態の障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性痙攣対麻痺(HSP)12、13、14、15などの様々な神経変性疾患に関与している。HSPは、下肢筋16、17を制御するコルチコ脊柱およびそれに続く障害の変性を特徴とする遺伝性神経障害の異種群である。本研究では、iPSC由来前脳ニューロンを用いて、HSPにおけるミトコンドリアの輸送および形態を評価する。この方法は、生きた培養における神経軸索のミトコンドリアダイナミクスを調べるためのユニークなパラダイムを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、赤蛍光色素とImageJソフトウェアを用いて神経軸索におけるミトコンドリア輸送と形態を解析する方法について説明し、いずれも神経変性疾患における軸索変性とミトコンドリア形態を研究するユニークなプラットフォームを提供する。プロトコルには、ミトコンドリアの染色、生細胞イメージング、画像の分析など、いくつかの重要なステップがあります。この方法では、ミトコ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、痙性対麻痺財団、ブレイザー財団、NIH(R21NS109837)によって支援されました。
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
Riferimenti
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