Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria
Summary
El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad neurodegenerativa.
Abstract
Las neuronas tienen intensas demandas de alta energía con el fin de apoyar sus funciones. Se ha observado un deterioro del transporte mitocondrial a lo largo de los axones en las neuronas humanas, que puede contribuir a la neurodegeneración en varios estados de la enfermedad. Aunque es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos, estos paradigmas son críticos para estudiar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración. Aquí se describe un protocolo para analizar el transporte mitocondrial y la morfología mitocondrial en axónicos de neuronas forebrain derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Los IPSCse se diferencian en neuronas glutamatérgicas telencéfalas utilizando métodos bien establecidos. Las mitocondrias de las neuronas están manchadas con MitoTracker CMXRos, y el movimiento mitocondrial dentro de los axones se captura mediante un microscopio de imágenes de células vivas equipado con una incubadora para el cultivo celular. Las imágenes de lapso de tiempo se analizan utilizando software con plugins “MultiKymograph”, “Bioformat importer” y “Macros”. Se generan kymographs de transporte mitocondrial, y la velocidad mitocondrial promedio en las direcciones anteroógradas y retrógradas se lee en el kymograph. En cuanto al análisis de morfología mitocondrial, la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto se obtienen utilizando el ImageJ. En resumen, este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axons y el análisis de su morfología para facilitar los estudios de enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
La motilidad mitocondrial y la distribución juegan un papel vital en el cumplimiento de las demandas energéticas variables y especializadas en las neuronas polarizadas. Las neuronas pueden extender axónes extremadamente largos para conectarse con objetivos a través de la formación de sinapsis, que exigen altos niveles de energía para Ca2+ amortiguación y corrientes ióndas. El transporte de mitocondrias de soma a axón es fundamental para apoyar la función axonal y sináptica de las neuronas. El movimiento mitocondrial dinámica espacial y temporal se lleva a cabo mediante un transporte axonal rápido a velocidades de varios micrómetros por segundo1.
Específicamente, las proteínas motoras o adaptadoras, como la cinaína y la dinanina, participan en el transporte rápido de orgánulos a lo largo de los microtúbulos para controlar el movimiento de las mitocondrias2,3. La actividad neuronal normal requiere el transporte adecuado de las mitocondrias recién ensambladas desde el soma neuronal al axón distal (transporte axonal anterogrado) y el transporte inverso de mitocondrias desde el axón distal de vuelta al cuerpo celular (transporte retrógrado). Estudios recientes han indicado que la asignación mitocondrial inadecuada está fuertemente asociada con defectos neuronales y enfermedades degenerativas de neuronas motoras4,5. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración, es importante establecer métodos para examinar el movimiento mitocondrial a lo largo de los axons en cultivos vivos.
Hay dos desafíos principales en el examen y análisis del seguimiento de las mitocondrias: (1) identificar las mitocondrias desde el fondo en cada fotograma, y (2) analizar y generar las conexiones entre cada fotograma. Para resolver el primer desafío, se utiliza ampliamente un enfoque de etiquetado de fluorescencia para distinguir las mitocondrias del fondo, como el tinte MitoTracker o la transfección de la proteína de orientación mitocondrial fusionada con fluorescencia (por ejemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analizar la asociación entre fotogramas, en estudios anteriores9se han descrito varios algoritmos y herramientas de software. En un artículo reciente, los investigadores compararon cuatro herramientas automatizadas diferentes (por ejemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck y Difference Tracker) para cuantificar el transporte mitocondrial. Los resultados mostraron que, a pesar de las discrepancias en la longitud de la pista, el desplazamiento mitocondrial, la duración del movimiento y la velocidad, estas herramientas automatizadas son adecuadas para evaluar la diferencia de transporte después del tratamiento10. Además de estas herramientas, un plugin integrado “Macros” para ImageJ (escrito por Rietdorf y Seitz) ha sido ampliamente utilizado para analizar el transporte mitocondrial11. Este método genera kymographs que se pueden utilizar para analizar el movimiento mitocondrial, incluyendo la velocidad en direcciones anterogradas y retrógradas.
Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que cambian constantemente en número y morfología en respuesta a condiciones fisiológicas y patológicas. La fiscalidad mitocondrial y la fusión regulan estrechamente la morfología mitocondrial y la homeostasis. El desequilibrio entre la fission mitocondrial y la fusión puede inducir redes mitocondriales extremadamente cortas o largas, lo que puede afectar la función mitocondrial y dar lugar a actividades neuronales anormales y neurodegeneración. El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están implicados en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la paraplejia espástica hereditaria (HSP)12,13,14,15. El HSP es un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos hereditarios caracterizadopor la degeneración del tracto corticoespinal y la posterior falta de control de los músculos inferiores de las extremidades16,17. En este estudio, las neuronas forebrain derivadas de iPSC se utilizan para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en HSP. Este método proporciona un paradigma único para examinar la dinámica mitocondrial de los axons neuronales en cultivos vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método para analizar el transporte mitocondrial y la morfología en axones neuronales utilizando tinte fluorescente rojo y software ImageJ, que proporcionan una plataforma única para estudiar la degeneración axonal y la morfología mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas. Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluyendo la tinción de las mitocondrias, la creación de imágenes de células vivas y el análisis de las imágenes. En este método, se utilizó un tinte fluorescente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Paraplejia Espástica, la Fundación Blazer y la NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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