거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱
Summary
치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.
Abstract
안 드로 겐 수용 체의 절제 (AR) 안 드로 겐 박탈에 의해 신호는 처음 암 회귀 결과 전립선 암에 대 한 치료의 첫 번째 라인의 목표. 그러나 상당수의 경우, 이 질병은 치료 옵션이 제한되어 있고 종종 공격적인 고급 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다. 먼 전이는 주로 공격적인 질병의이 단계에서 관찰됩니다. CRPC는 초기에 생존을 향상시키는 2세대 AR 통로 억제제에 의해 치료되고, 치료 저항성의 출현이 뒤따랐다. 신경 내분비 전립선암 (NEPC)은 종종 신경 내분비 분화 (NED)로 알려진 분화 과정을 통해 치료 저항의 결과로 발생하는 전립선 암 (PCa)의 드문 변이체이며, PCa 세포는 계보 스위치를 겪는다. 선암에서 신경 내분비 (NE) 계보 마커의 증가 된 발현을 보여줍니다. NEPC에 진행및 분화를 유도하는 게놈 변경 이외에, 후성 유전학 요인 및 미세 환경 단서는 질병 진행을 구동에 필수적인 선수로 간주됩니다. 이 원고는 고급 PCa와 연관된 후성 유전학 드라이버(즉, 작은 비코딩 RNA)를 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 전이성 조직과 그에 상응하는 혈청 유래 세포외 소포(EV)의 정제된 마이크로RNA를 사용하여 시퀀싱에 적합한 품질 관리를 통해 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 샘플 소스에서 microRNA. FFPE와 EV 모두에서 RNA를 분리하는 것은 종종 도전적이다 그것의 대부분은 저하 또는 수량에 제한되기 때문에. 이 프로토콜은 RNA 입력 및 cDNA 라이브러리를 최적화하여 시퀀싱 시 가장 구체적인 판독 및 고품질 데이터를 산출하는 다양한 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Introduction
전립선암은 AR 신호를 통해 작용하는 안드로겐에 의해 구동됩니다. 따라서, AR 통로를 표적으로 하는 것은 질병1에대한 주된 치료이다. 그러나, 저항은 표적으로 한 치료의 결과로 수시로 계속되고 질병은 향상된 전이성 CRPC2로점진합니다. CRPC는 엔잘루타미드와 아비라테론2,3을 포함하는 2세대 AR 요법에 의해 치료되며, 이는 초기에 생존을 향상시킨다. 그러나, NEPC와 같은 치명적인 이체는 수시로 증가한사망3로이끌어 내는 한정된 처리한 CRPC 케이스의 25-30%에서 나타납니다. NEPC는 NED로 알려진 가역적 분화 과정을 통해 발생하며, 여기서 PCa 세포는 선암으로부터 계보 전환을 거치고 AR의 대사감소 및 에놀라제 2(ENO2), 염색그라닌 A(CHGA) 및 시냅토피신(SYP)을 포함하는 NE 계보 마커의 발현 증가를 보여준다. 이러한 저항 변이체는 치료 적 개입의 결과로 발생 감안할 때, PCa의 형태를 치료하기 어려운이 치명적인 의 생성으로 이어지는 경로를 해독하는 것이 필수적이다.
NEPC의 유전체학은 최근 Beltran 등에서 수행한 철저한 연구에서 해독되었으며, 이에 의해 카피 수 변경, 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 및 환자 유래 전이성 조직으로부터의 DNA 메틸화를 분석하였다5. PCa의 이 공격적인 양식의 유전체학의 이해에 있는 중요한 전진에도 불구하고, NEPC에 CRPC 선암의 전환에 관여하는 작은 비코딩 RNA (microRNAs)를 포함하여 후성적인 요인에 관하여 거의 알려지지 않습니다. MicroRNAs(miRNAs)는 22 bp 길이, 이중 가닥 RNA로, 코그네이트 mRNA 표적의 3′-번역되지 않은 영역(UTRs)과의 서열 특이적 상호작용에 의해 유전자 발현 후 전사를 억제함으로써 주로 작용한다6. 몇몇 oncomirs 및 종양 억제제는 지금 확인되고, 질병 개시 및 전이 조절에 있는 그들의 역할은 다른암6,7에서잘 공부되었습니다. 이러한 작은 비코딩 RNA는 종종 질병 사망률6,8,9를조절하는 데 매우 중요한 표적으로 작용한다. 보다 최근의 연구는 엑소좀과 같은 엑소좀에서의 수송을 통해 암 전이에서 miRNAs의 파라크린 효과를 이해하는 데 초점을 맞추고 있으며, 이는 혈류에서 흐르고 종양 세포가 이러한 이차 메신저를 뉴클레아제 없는 환경에서 전이성 위치로 보낼 수 있도록하는 10,11,12. EV는 숙주세포(12)로부터형질전환 효과를 전달하기 위해 종양 세포로부터 miRNAs를 운반한다. 따라서 종양 세포의 이차 메신저로서 EV의 식별은 질병 중증도의 비침습적 검출에 유용할 수 있다.
miR-1246은 공격적인 PCa로부터 전기자동차에서 고도로 상승조절되며, 질병 중증도13을나타낸다. 이 EV 관련 miRNAs는 질병의 비침범성 biomarkers로 봉사할 뿐 아니라, 또한 종양 발생을 운전에 있는 기능적으로 중요한 역할을 합니다. 따라서, 비침습적 바이오마커의 더 나은 식별뿐만 아니라 그들의 기능적 중요성을 더 잘 식별할 수 있도록 PCa의 내성 형태와 연관되는 miRNA 레퍼토리의 중요성을 이해하는 것이 필수적이다.
차세대 염기서열 분석의 출현은 돌연변이, 염색체 재배치, 염색체 및 메틸화와 같은 게놈의 변경을 수반하는 종양 경관의 세부 사항을 연구하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공했으며, 이들 모두는 암의 형태와 특성에 크게 기여하고있다 14,15,16. 마찬가지로, 종양 세포에서 발생하는 광대한 후성 유전체 학적 변화를 이해하는 데 필수적인 도구이며 질병 중증도17에서종종 중요한 선수입니다. NEPC의 생성과 관련된 miRNA 레퍼토리를 이해하기 위한 목적으로, FFPE 전이성 CRPC 조직 및 이들의 상응하는 혈청 유래 EV에서 작은 RNA 염기서열 분석이 수행되었습니다. 이들 두 샘플 공급원 중 어느 하나에서 유래된 RNA는 (1) 수율이 낮고 (2) 포르말린 고정 및 EV 격리로 인해 종종 발생하는 열화로 인한 품질 불량이다. 또한 cDNA 라이브러리를 생성하는 것은 중요하지만 번거로운 순서 실행 단계입니다. 따라서 이러한 RNA를 격리하고 이를 사용하여 작은 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하는 방법은 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하기 위한 최적화가 필요합니다.
RT-PCR, 마이크로어레이 및 인-시트 혼성화(ISH)를 포함하여 상이한 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일화하는 몇 가지 방법이 있다. RT-PCR 및 ISH에 의한 miRNA 발현을 평가하기 위해 FFPE 조직 유래 RNA를 이용한 프로토콜은 최근18일발표되었다. 최신 기술은 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일링하기 위한 보다 철저하고 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. NanoString nCounter는 민감한 miRNA 검출플랫폼(19)을제공하지만, 검출은 종종 어레이에서 이용 가능한 miRNAs의 수에 의해 제한된다(~2,000). 이러한 시나리오에서, 차세대 시퀀싱과 같은 보다 민감하고 철저한 플랫폼은 상이한 샘플20에서훨씬 더 넓은 깊이의 miRNA 식별 및 동시 프로파일링을 제공한다. 상기 방법은 PCa환자21,22,23으로부터소변 또는 혈장에서 miRNA 서명을 결정하는 데 사용되어 왔다. 현재 기사에서, 프로토콜은 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV RNA를 사용하여 공격적인 CRPC와 관련된 miRNA 프로파일을 연구하기 위해 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는, 우리는 격리된 RNA의 수율 그리고 질을 증가시키기 위하여 최적화된 키트를 사용하여 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV에서 RNA를 격리하는 프로토콜을 기술합니다. 또한, 정제된 RNA는 작은 RNA 염기서열 분석용 cDNA 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 나열된 두 단계는실행(24)의최종 결과인 시퀀싱 판독의 품질 및 깊이를 결정하는 데 필수적이다. 따라서 이러한 중요한 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미 육군 의학 연구 획득 활동 (USAMRAA)에 의해 지원된다 아이디어 개발 상을 통해 수상 번호. W81XWH-18-1-303 및 W81XWH-18-2-0013 및 추가 로 수상 번호. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, W81XWH-18-2-0018, 및 W81XWH-18-2-0019 전립선암 바이오리포시토리 네트워크(PCBN). 건강의 국가 학회에 있는 국립 암 학회에 의해 저자의 실험실에 자금 지원 (그랜트 번호 RO1CA177984) 또한 인정됩니다. Rajvir Dahiya는 재향 군인 업무부, BX004473의 수석 연구 경력 과학자이며 NIH-UO1CA199694 (RD)의 지원을 받습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부 또는 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 샌프란시스코 VAMC의 핵심 시설 책임자인 주디 시게나가(Judy Shigenaga)가 NextSeq 500 시퀀서에 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
Riferimenti
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