تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة
Summary
يتجلى هنا هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية والثقافة ، والتمييز بين الخلايا الجذعية المادة البيضاء من المخيخ الماوس بعد الولادة.
Abstract
معظم الخلايا العصبية المخيخ تنشأ من اثنين من المنافذ الجذعية الجنينية: كوة الشفاه rhombic، الذي يولد جميع الخلايا العصبية الجلوتاتيرية المنقفية المخيخ، ومكانة المنطقة البطينية، والتي تولد الخلايا GABAergic Purkinje المثبطة، والتي هي الخلايا العصبية التي تشكل نواة المخيخ العميق وبيرغمان جليا. في الآونة الأخيرة ، وصفت مكانة ثالثة للخلايا الجذعية التي تنشأ كمنطقة إنباتية ثانوية من منطقة البطين. يتم تعريف خلايا هذا المتخصصة من قبل علامة سطح الخلية prominin-1 ويتم توطينها إلى المسألة البيضاء النامية من المخيخ بعد الولادة. هذا المتخصصة حسابات للطبقة الجزيئية ولدت في وقت متأخر GABAergic interneurons جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية المخيخ ولدت بعد الولادة. بالإضافة إلى دورها التنموي ، تكتسب هذه المتخصصة أهمية ترجمة فيما يتعلق بمشاركتها في التنكس العصبي وورم. كان من الصعب فك شفرة بيولوجيا هذه الخلايا بسبب عدم وجود تقنيات فعالة لتنقيتها. أظهرت هنا هي أساليب فعالة لتنقية والثقافة، والتمييز بين هذه الخلايا الجذعية المخيخ بعد الولادة.
Introduction
وقد اعترف المخيخ منذ فترة طويلة كدائرة الخلايا العصبية الرئيسية تنسيق الحركة الطوعية1. ويتلقى مدخلات من مساحات واسعة من المحور العصبي ، والذي يتضمن معلومات تنبؤية من المحيط ، وذلك لضبط إخراج المحرك وتنسيق الحركة. في الآونة الأخيرة ، كما تورط في تنظيم الإدراك والعواطف عن طريق استخدام شبكات معالجة المعلومات المماثلة2،3،4.
يتكون المخيخ البالغ من قشرة المخيخ الخارجي والمادة البيضاء الداخلية. تتخللها داخل هذه الهياكل هي نواة عميقة intracerebellar. على غرار بقية الجهاز العصبي ، يتم تحفيز تطور المخيخ بسبب انتشار الخلايا السلف متعددة القدرات (الخلايا الجذعية) التي تهاجر وتفرق لتسفر عن هذا الهيكل المنظم جيدًا. في التنمية المبكرة (E10.5 -E13.5) ، والمتخصصة الجذعية البطينية حول البطين الرابع النامية يولد الخلايا العصبية GABAergic (أي، خلايا Purkinje، خلايا لوغانو، خلايا غولجي) جنبا إلى جنب مع بيرغمان غليا5،6،7،8.
في وقت لاحق في التنمية (بعد الولادة الأسبوع الأول), مكانة الخلية الجذعية الثانية في الشفة rhombic يولد MATH1- ونستين التعبير عن السلف التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الحبيبية مثير9,10,11,12. في الآونة الأخيرة تم وصف مكانة ثالثة للخلايا الجذعية13. هذه الخلايا التعبير عن prominin-1 (المعروف أيضا باسم CD133), غشاء تمتد الجليكوبروتين الذي يحدد مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية في الأمعاء والنظم الهيماتوبويتيك14,,15,,16. في خريطة مصير الجسم الحي يظهر أن هذه الخلايا الجذعية تولد الطبقة الجزيئية الرئيسية interneurons (أي خلايا السلال والخلايا ستيلاتي)، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة. في الماضي، كان من الصعب دراسة هذه الخلايا في المختبر لأن الأساليب السابقة قد تتطلب تقنيات مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (أي، فرز الخلايا المنشطة فلورسينس [FACS]) التي تعتمد على prominin-1 تلطيخ12،,13،,17. يصف هذا البروتوكول طريقة تعتمد على المغناطيسية المناعية لعزل هذه الخلايا الجذعية التي يمكن بعد ذلك أن تكون مثقفة ومتمايزة بسهولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الجذعية الركرياتين-1-التعبير عن المخيخ يقيم في المادة البيضاء المحتملة خلال الأسابيع 3 الأولى من الحياة بعد الولادة. يتم التحكم في انتشارها بإحكام من قبل مسار القنفذ الصوتي الذي تدعمه خلايا Purkinje17. هذه الخلايا الجذعية / السلف تسهم في لاحق ولدت GABAergic interneurons تسمى خلايا ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر أوبال على اقتراحاتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح 1RO1 NS062051 و 1RO1NS08251 (أوبال P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
Riferimenti
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscienze. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologia dello sviluppo. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
