प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से प्रोमिनिन-1+ स्टेम सेल का शुद्धिकरण
Summary
यहां प्रदर्शित प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से सफेद पदार्थ स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध करने, संस्कृति और अंतर करने के लिए एक कुशल और लागत प्रभावी तरीका है।
Abstract
अधिकांश सेरिबैलर न्यूरॉन्स दो भ्रूणीय स्टेम निकस से उत्पन्न होते हैं: एक रॉम्बिक लिप आला, जो सभी सेरिबेलर उत्तेजक ग्लूटाम्बिक न्यूरॉन्स, और एक वेंट्रिकुलर जोन आला उत्पन्न करता है, जो निरोधात्मक गैबार्गिक पुरकिंजे कोशिकाओं को उत्पन्न करता है, जो न्यूरॉन्स हैं जो गहरे सेरिबेलर न्यूक्लिरी और बर्गमैन ग्लिया का गठन करते हैं। हाल ही में, एक तिहाई स्टेम सेल आला का वर्णन किया गया है कि वेंट्रिकुलर क्षेत्र आला से एक माध्यमिक अंकुरित क्षेत्र के रूप में उठता है । इस आला की कोशिकाओं को सेल सतह मार्कर प्रोमिनिन-1 द्वारा परिभाषित किया गया है और प्रसवोत्तर सेरिबैलम के विकासशील सफेद पदार्थ के लिए स्थानीयकृत हैं। यह आला प्रसवोत्तर उत्पन्न सेरिबैलर एस्ट्रोसाइट्स के साथ देर से जन्म लेने वाले आणविक परत गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के लिए खाता है। उनकी विकासात्मक भूमिका के अलावा, यह आला न्यूरोडिजेनरेशन और ट्यूमरजेनेसिस में इसकी भागीदारी के संबंध में अनुवाद महत्व प्राप्त कर रहा है। इन कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने के लिए मुश्किल हो गया है क्योंकि उनके शुद्धिकरण के लिए कुशल तकनीकों की कमी है । यहां प्रदर्शित इन प्रसवोत्तर सेरिबैलर स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध करने, संस्कृति और अंतर करने के लिए कुशल तरीके हैं।
Introduction
सेरिबैलम को लंबे समय से स्वैच्छिक आंदोलन के समन्वय वाले एक प्रमुख न्यूरोनल सर्किटकेरूप में पहचाना जाता रहा है । यह न्यूरोएक्सिस के व्यापक swathes से इनपुट प्राप्त करता है, जिसमें परिधि से प्रोप्रोसेप्टिव जानकारी शामिल है, ताकि मोटर आउटपुट को ठीक किया जा सके और गति का समन्वय किया जा सके। हाल ही में, इसे संभावित रूप से इसी तरह के सूचना,प्रसंस्करण नेटवर्क2,3,4का उपयोग करके अनुभूति और भावनाओं को विनियमित करने में भी फंसाया गया है।4
वयस्क सेरिबैलम एक बाहरी सेरिबेलर कॉर्टेक्स और आंतरिक सफेद पदार्थ से बना है। इन संरचनाओं के भीतर इंटरस्पर्ड गहरे इंट्रारिबेलर नाभिक हैं। तंत्रिका तंत्र के बाकी हिस्सों के समान, सेरिबैलम का विकास बहुशक्तिशाली जनक कोशिकाओं (स्टेम सेल) के प्रसार से प्रेरित होता है जो इस अच्छी तरह से संगठित संरचना को उपज देने के लिए माइग्रेट और अंतर करते हैं। प्रारंभिक विकास (E10.5-E13.5) में, विकासशील चौथे वेंट्रिकल के चारों ओर एक वेंट्रिकुलर स्टेम आला बर्गमैन ग्लिया5,,6,,7,,8के साथ गैबाएर्गिक न्यूरॉन्स (यानी, पुरकिंजे कोशिकाओं, लुगरो कोशिकाओं, गोल्गी कोशिकाओं) उत्पन्न करता है।
बाद में विकास (प्रसवोत्तर सप्ताह एक) में, रोम्बिक होंठ में एक दूसरा स्टेम सेल आला MATH1 उत्पन्न करता है- और नेटिन-व्यक्त करने वाले जनक जो उत्तेजक कणिका न्यूरॉन्स9,,10,,11,,12को जन्म देते हैं। हाल ही में एक तिहाई स्टेम सेल आला13वर्णित किया गया है । ये कोशिकाएं प्रोमिनिन-1 (जिसे सीडी 133 के नाम से भी जाना जाता है) को व्यक्त करती हैं, एक झिल्ली-फैले ग्लाइकोप्रोटीन जो आंत में स्टेम कोशिकाओं के सबसेट और हेमेटोपोइटिक सिस्टम14,15,,16को परिभाषित करता है। वीवो भाग्य मानचित्रण में पता चलता है कि ये स्टेम सेल पहले तीन प्रसवोत्तर सप्ताहों के दौरान एस्ट्रोसाइट्स के साथ-साथ प्रमुख आणविक परत इंटरन्यूरॉन्स (यानी, टोकरी कोशिकाओं और स्टेलेट कोशिकाओं) उत्पन्न करते हैं। अतीत में, इन कोशिकाओं का अध्ययन करना मुश्किल रहा है क्योंकि पूर्व तरीकों में महंगी और समय लेने वाली तकनीकों (यानी, फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई [FACS]) की आवश्यकता होती है जो प्रोमिनिन-1 धुंधला12,,13,,17पर निर्भर हैं। यह प्रोटोकॉल इन स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक इम्यूनोमैग्नेटिक आधारित विधि का वर्णन करता है जिसे फिर आसानी से सुसंस्कृत और विभेदित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोमिनिन-1- व्यक्त करने वाले सेरिबेलर स्टेम सेल प्रसवोत्तर जीवन के पहले 3 हफ्तों के दौरान संभावित सफेद पदार्थ में रहते हैं। उनके प्रसार को पुरकिंजे कोशिकाओं द्वारा समर्थित ध्वनि हेजहोग मार्ग द्वारा ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ओपल लैब के सदस्यों को उनके सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच ग्रांट 1RO1 NS062051 और 1RO1NS08251 (Opal P) द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
Riferimenti
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscienze. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologia dello sviluppo. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
