Rensing av Prominin-1+ stamceller fra postnatal mus cerebellum
Summary
Demonstrert her er en effektiv og kostnadseffektiv metode for å rense, kultur, og skille hvite materie stamceller fra postnatal mus cerebellum.
Abstract
De fleste cerebellar nevroner oppstår fra to embryonale stammen nisjer: en rhombic leppe nisje, som genererer alle cerebellar excitatory glutamatergic nevroner, og en ventrikulær sone nisje, som genererer hemmende GABAergic Purkinje celler, som er nevroner som utgjør dyp cerebellar kjerner og Berg glimana. Nylig har en tredje stamcellenisje blitt beskrevet som oppstår som en sekundær germinal sone fra ventrikulær sone nisje. Cellene i denne nisjen er definert av celleoverflatemarkøren prominin-1 og er lokalisert til den utviklende hvite saken om postnatal cerebellum. Denne nisjen står for det avdøde fødte molekylære laget GABAergic interneurons sammen med postnatalt genererte cerebellar astrocytter. I tillegg til deres utviklingsrolle, er denne nisjen økende translasjonell betydning i forhold til sitt engasjement i nevrodegenerasjon og tumorigenesis. Biologien til disse cellene har vært vanskelig å tyde på grunn av mangel på effektive teknikker for rensing. Demonstrert her er effektive metoder for å rense, kultur, og skille disse postnatale cerebellar stamceller.
Introduction
Lillehjernen har lenge blitt anerkjent som en stor nevronal krets som koordinerer frivillig bevegelse1. Den mottar innspill fra de brede swathes av nevroaksen, som inkluderer proprioceptive informasjon fra periferien, slik som å finjustere motorutgang og koordinere bevegelse. Mer nylig har det også vært innblandet i å regulere kognisjon og følelser ved potensielt å bruke lignende informasjonsbehandlingsnettverk2,3,4.
Den voksne lillehjernen består av en ytre cerebellar cortex og indre hvit materie. Ispedd i disse strukturene er dype intracerebellar kjerner. I likhet med resten av nervesystemet, er utviklingen av lillehjernen drevet av spredning av multipotente stamceller (stamceller) som migrerer og skiller seg ut for å gi denne velorganiserte strukturen. I tidlig utvikling (E10.5–E13.5), en ventrikulær stamme nisje rundt den utviklende fjerde ventrikkelen genererer GABAergic nevroner (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) sammen med Bergmann glia5,6,7,8.
Senere i utviklingen (postnatal uke en), en andre stamcelle nisje i rhombic leppegenererer MATH1- og Nestin-uttrykkende forfedre som gir opphav til eksitatoriskgranule nevroner9,10,11,12. Nylig har en tredje stamcelle nisje blitt beskrevet13. Disse cellene uttrykker prominin-1 (også kjent som CD133), en membran-spenner glykoprotein som definerer en undergruppe av stamceller i tarmen og hematopoetiske systemer14,15,16. In vivo skjebne kartlegging viser at disse stamcellene genererer viktige molekylære lag interneurons (dvs. kurvceller og stellate celler), sammen med astrocytter, i løpet av de tre første postnatal uker. Tidligere har det vært vanskelig å studere disse cellene in vitro fordi tidligere metoder har krevd kostbare og tidkrevende teknikker (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS]) som er avhengig av prominin-1 farging12,13,17. Denne protokollen beskriver en immunomagnetisk basert metode for isolering av disse stamcellene som deretter lett kan dyrkes og differensieres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-uttrykkende cerebellære stamceller bor i den potensielle hvite substansen i løpet av de første 3 ukene av postnatal liv. Deres spredning er tett kontrollert av den soniske pinnsvinbanen som støttes av Purkinje celler17. Disse stamcellene/stamfarene bidrar til senere fødte GABAergic interneurons kalt kurvceller og stellateceller. Disse interneurons bor i det molekylære laget, hvor de synapse på Purkinje celler og forme PC topografi og funksjon via GABAergic hemming<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Opal-laboratoriemedlemmene for deres forslag. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd 1RO1 NS062051 og 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
Riferimenti
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscienze. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologia dello sviluppo. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
