Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum
Summary
Hier gedemonstreerd is een efficiënte en kosteneffectieve methode om witte stof stamcellen te zuiveren, te kweken en te onderscheiden van postnatale muiscerebellum.
Abstract
De meeste cerebellar neuronen ontstaan uit twee embryonale stam niches: een rhombic lip niche, die alle cerebellar excitatory glutamatergic neuronen genereert, en een ventriculaire zone niche, die de remmende GABAergic Purkinje cellen genereert, die neuronen die de diepe cerebellar kernen en Bergman glia vormen genereert. Onlangs is een derde stamcelniche beschreven die ontstaat als een secundaire kiemzone uit de ventriculaire zone niche. De cellen van deze niche worden gedefinieerd door de celoppervlak marker prominin-1 en zijn gelokaliseerd op de zich ontwikkelende witte stof van de postnatale cerebellum. Deze niche is goed voor de laat geboren moleculaire laag GABAergic interneurons samen met postnataal gegenereerde cerebellar astrocyten. Naast hun ontwikkelingsrol wint deze niche translationeel belang met betrekking tot zijn betrokkenheid bij neurodegeneratie en tumorigenese. De biologie van deze cellen is moeilijk te ontcijferen vanwege een gebrek aan efficiënte technieken voor hun zuivering. Hier gedemonstreerd zijn efficiënte methoden om te zuiveren, cultuur, en onderscheiden van deze postnatale cerebellar stamcellen.
Introduction
De cerebellum is al lang erkend als een grote neuronale circuit coördinatie van vrijwillige beweging1. Het ontvangt input van de brede delen van de neuroas, die proprioceptieve informatie van de periferie omvat, om motoroutput te finetunen en beweging te coördineren. Meer recent, het is ook betrokken bij het reguleren van cognitie en emoties door potentieel gebruik van soortgelijke informatie verwerking netwerken2,3,4.
Het volwassen cerebellum bestaat uit een buitenste cerebellar cortex en innerlijke witte stof. Gestrooid binnen deze structuren zijn diepe intracerebellar kernen. Net als bij de rest van het zenuwstelsel, wordt de ontwikkeling van het cerebellum gedreven door de proliferatie van multipotente voorlopercellen (stamcellen) die migreren en differentiëren om deze goed georganiseerde structuur op te leveren. In de vroege ontwikkeling (E10.5–E13.5), een ventriculaire stam niche rond de zich ontwikkelende vierde ventrikel genereert GABAergic neuronen (dat wil zeggen, Purkinje cellen, Lugaro cellen, Golgi cellen) samen met Bergmann glia5,6,7,8.
Later in ontwikkeling (postnatale week één), genereert een tweede stamcelniche in de rhombic lip MATH1- en Nestin-expressing progenitors die aanleiding geven tot excitatory granulaatneuronen9,10,11,12. Onlangs een derde stamcel niche is beschreven13. Deze cellen express prominin-1 (ook bekend als CD133), een membraan-spanning glycoproteïne dat een subset van stamcellen in de darm en hematopoietische systemen14,,15,16definieert . In vivo fate mapping toont aan dat deze stamcellen genereren belangrijke moleculaire laag interneurons (dat wil zeggen, mandcellen en stellate cellen), samen met astrocyten, tijdens de eerste drie postnatale weken. In het verleden was het moeilijk om deze cellen in vitro te bestuderen, omdat eerdere methoden dure en tijdrovende technieken (d.w.z. fluorescentie-geactiveerde celsortering [FACS]) nodig hebben die afhankelijk zijn van prominine-1-kleuring12,13,17. Dit protocol beschrijft een immunomagnetische methode voor de isolatie van deze stamcellen die vervolgens gemakkelijk kan worden gekweekt en gedifferentieerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-uitdrukkende cerebellar stamcellen wonen in de toekomstige witte stof tijdens de eerste 3 weken van het postnatale leven. Hun proliferatie wordt strak gecontroleerd door de sonische egelroute die door cellen Purkinje wordt gesteund17. Deze stamcellen/voorlopers dragen bij aan later geboren GABAergic interneurons genaamd basket cells en stellate cells. Deze interneurons bevinden zich in de moleculaire laag, waar ze synaps op Purkinje cellen en beeldhouwen PC topografie en functie via GAB…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Opal lab leden voor hun suggesties. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies 1RO1 NS062051 en 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
Riferimenti
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscienze. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologia dello sviluppo. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
