ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出
Summary
このプロトコルは、ナマコアポスピコプスジャポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法を提供し、エキノデルマ、モルスカ、甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があります。
Abstract
一次培養細胞は、生物物質の機能評価や特定の生物学的活動の特徴付けのための非常に重要なツールとして、様々な科学的分野で使用されています。しかしながら、普遍的に適用可能な細胞培養培地およびプロトコルの欠如のために、海洋生物に対する細胞培養方法は依然として限定的である。一方、海洋無脊椎動物細胞の一般的に起こっている微生物汚染および多発性特性は、海洋無脊椎動物に対する効果的な細胞培養戦略の確立をさらに妨げる。ここでは、ナマコアポジコプスヤポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法について説明します。さらに、一次培養腸細胞におけるインビトロアポトーシス誘導および検出の例を提供する。また、本実験では、適切な培養培地及び細胞採取方法について詳細を提供する。記載されたプロトコルは、エキノデルマタ、モルスカ、および甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があり、複数のin vitro実験用途に十分な細胞を提供することができる。この技術により、研究者は海洋無脊椎動物からの一次細胞培養物を効率的に操作し、細胞上の標的生物学的物質の機能的評価を容易にすることが可能になる。
Introduction
人工的に制御された条件下で細胞を培養し、自然環境ではなく、特に実験室環境で容易に培養できない種に対して、生物学的研究のための均一な実験材料を提供します。海洋無脊椎動物は全動物種1の30%以上を占め、再生2、3、ストレス応答4、環境適応5、6などの特定の生物学的プロセスの調節機構に関する研究を行うための多数の生物学的材料を提供する。
ナマコ、アポストコモスジャポニクスは、北太平洋沿岸の温帯水域に生息する最も研究されたエキノデルム種の一つです。東アジア、特に中国7では、商業的に重要な種として知られており、大規模にマリカルチャーされています。A.ジャポニクスに関する多くの科学的な質問は、死後8後の腸の再生の基礎となる調節機構および失神9の変性、代謝制御10、11、および免疫応答12、13熱ストレスまたは病原性ストレス下で、研究者の注目を集めている。しかしながら、よく研究されたモデル動物と比較して、基礎研究、特に細胞レベルに関する研究は、高度な細胞培養方法の欠如などの技術的なボトルネックによって制限される。
研究者は細胞株の確立に多くの努力を捧げてきたが、彼らはまた、多くの課題に直面しており、海洋無脊椎動物からの細胞株はまだ14を確立していない。しかし、海洋無脊椎動物からの一次細胞培養は、過去数十年で進歩した15、16、そして彼らは細胞レベルで実験する機会を提供している。例えば、A.ジャポニクスからの再生インテシンは、海洋無脊椎動物17の一次細胞培養のための実用的な方法を提供した長期細胞培養のための細胞源として利用されている。このプロトコルは、無脊椎動物細胞培養アプローチを組み合わせ、最適化し、ナマコまたは他の海洋無脊椎動物に広く適した一次培養方法を開発した。
アポトーシスは、様々な内因性および内因性刺激によって引き起こされる本質的な細胞自殺プログラムである。協調アポトーシスは、多くの生物学的システム18、19にとって極めて重要であり、そして、それは、アスティベーション9の間にナマコの腸の退行に関与している。目的の生物におけるアポトーシス過程を調べるために、Hoechst染色および顕微鏡アッセイを含む一連の方法が確立され、20を正常に適用した。ここでは、ナマコの一次培養腸細胞におけるアポトーシス誘導と検出を行い、海洋無脊椎動物の生物学的研究における一次細胞の使いやすさを評価した。一般的に使用される合成グルココルチコステロイド21の一つであるデキサメタゾンは、ナマコから培養腸細胞にアポトーシスを誘導するために使用され、有意なHoechst 33258シグナルは蛍光顕微鏡により染色細胞内で検出に成功した。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去数十年にわたり、細胞株の確立に向けた広範な研究努力が行われてきましたが、海洋無脊椎動物14、22からの細胞の長期培養の進展はまだ困難です。ホロチュリアン組織の再生から培養した細胞は長期間生存し、増殖の高い活性が特定の細胞17、23で検出できることが報告されている。しかしながら、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは浙江大学のナイミング周教授の技術アドバイスと研究室の設備の利用に感謝したいと思います。この研究は、中国国立自然科学財団(補助金番号41876154、41606150、41406137)と浙江省の大学・研究機関のための基礎研究基金[補助金番号2019JZ00007]によって財政的に支えられた].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
Riferimenti
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