In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.
Hier beschrijven we een in vitro cultuurtest om coronaire angiogenese te bestuderen. Coronaire bloedvaten voeden de hartspier en zijn van klinisch belang. Defecten in deze bloedvaten vertegenwoordigen ernstige gezondheidsrisico’s, zoals bij atherosclerose, wat kan leiden tot hartinfarcten en hartafwijkingen bij patiënten. Bijgevolg, coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ondanks het klinische belang, relatief weinig vooruitgang is geboekt op het gebied van het regenereren van beschadigde kransslagaders. Niettemin is er recente vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire oorsprong en differentiatietrajecten van coronaire vaatontwikkeling. De komst van tools en technologieën die onderzoekers in staat stellen om fluorescerende label voorlopercellen, volgen hun lot, en visualiseren progenies in vivo zijn instrumenteel in het begrijpen van coronaire schip ontwikkeling. In vivo studies zijn waardevol, maar hebben beperkingen in termen van snelheid, toegankelijkheid en flexibiliteit in experimenteel ontwerp. Als alternatief kunnen nauwkeurige in vitro modellen van coronaire angiogenese deze beperkingen omzeilen en onderzoekers in staat stellen om belangrijke biologische vragen snel en flexibel te ondervragen. Het ontbreken van geschikte in vitro modelsystemen kan de vooruitgang in het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire vaatgroei hebben belemmerd. Hier beschrijven we een in vitro cultuursysteem om kransslagaders te laten groeien uit de sinusvenosus (SV) en endocardium (Endo), de twee voorloperweefsels waaruit veel van de kransslagaders voortkomen. We hebben ook bevestigd dat de culturen nauwkeurig een aantal van de bekende in vivo mechanismen samenvatten. Zo tonen we aan dat de angiogene spruiten in de cultuur van SV downregulate COUP-TFII expressie vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Daarnaast tonen we aan dat VEGF-A, een bekende angiogene factor in vivo, angiogenese van zowel de SV- als Endo-culturen robuust stimuleert. Gezamenlijk hebben we een nauwkeurig in vitro cultuurmodel bedacht om coronaire angiogenese te bestuderen.
Bloedvaten van het hart worden vaak coronaire bloedvaten genoemd. Deze vaten bestaan uit slagaders, aders en haarvaten. Tijdens de ontwikkeling worden eerst sterk vertakte haarvaten aangelegd, die vervolgens worden verbouwd tot kransslagaders en aders1,2,3,4,5. Deze eerste haarvaten zijn opgebouwd uit endotheelvoorlopercellen gevonden in het proepicardium, sinus venosus (SV) en endocardium (Endo) weefsels1,6,7,8. SV is het instroomorgaan van het embryonale hart en Endo is de binnenvoering van het hartlumen. Endotheel voorlopercellen gevonden in de SV en Endo bouwen de meerderheid van de coronaire vasculatuur, terwijl het proepicardium bijdraagt aan een relatief klein deel van het2. Het proces waarbij het capillaire netwerk van kransslagaders in het hart uit zijn reeds bestaande voorlopercellen groeit, wordt coronaire angiogenese genoemd. Coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd en toch ontbreekt een effectieve behandeling voor deze ziekte. Inzicht in de gedetailleerde cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese kan nuttig zijn bij het ontwerpen van nieuwe en effectieve therapieën te herstellen en te regenereren beschadigde kransslagaders.
Onlangs is een toename in ons begrip van hoe coronaire schepen ontwikkelen gedeeltelijk is bereikt door de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en technologieën. Met name in vivo zijn de etikettering seinage-etikettering en geavanceerde beeldvormingstechnologieën zeer nuttig geweest bij het blootleggen van de cellulaire oorsprong s- en differentiatietrajecten van kransslagaders9,10,11,12. Ondanks de voordelen van deze in vivo tools, zijn er beperkingen op het gebied van snelheid, flexibiliteit en toegankelijkheid. Daarom kunnen robuuste in vitro modelsystemen in vivo systemen aanvullen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese op een hoge doorvoermanier op te helderen.
Hier beschrijven we een in vitro model van coronaire angiogenese. We hebben een in vitro explant kweeksysteem ontwikkeld om kransslagaders te kweken uit twee voorloperweefsels, SV en Endo. Met dit model laten we zien dat de in vitro weefselexplantculturen coronaire vaatspruiten kweken wanneer ze worden gestimuleerd door groeimedium. Bovendien groeien de explantculturen snel in vergelijking met controle wanneer ze worden gestimuleerd door vasculaire endotheelgroeifactor A (VEGF-A), een zeer krachtig angiogeen eiwit. Verder vonden we dat de angiogene spruiten uit de SV-cultuur veneuze dedifferentiatie ondergaan (verlies van COUP-TFII-expressie), een mechanisme vergelijkbaar met SV angiogenese in vivo1. Deze gegevens suggereren dat het in vitro explantcultuursysteem angiogene gebeurtenissen die in vivo voorkomen getrouw herstelt. Collectief, in vitro modellen van angiogenese die hier worden beschreven zijn ideaal voor het indringende cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese in een hoge doorvoer en toegankelijke manier.
Enkele van de meest kritische stappen voor het succesvol kweken van kransslagaders van de SV en Endo voorloperweefsels zijn: 1) Het correct identificeren en isoleren van het SV-weefsel voor sv-cultuur; 2) het gebruik van ventrikels uit embryo’s tussen de leeftijden van e11−11.5 voor een nauwkeurige Endo-cultuur; 3) het handhaven van steriele omstandigheden gedurende de gehele dissectieperiode en het te allen tijde koud houden van de weefsels; en 4) het houden van de explants aan het ecm gecoate membraan om te voorkomen…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken de leden van het Sharma laboratorium voor het verstrekken van een ondersteunende onderzoeksomgeving. Wij willen graag speciale dank aan Diane (Dee) R. Hoffman die onderhoudt en zorgt voor onze muis kolonie. We willen ook Drs. Philip J. Smaldino en Carolyn Vann bedanken voor het grondig nalezen van het manuscript en het verstrekken van nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van Ball State University Provost Office en Department of Biology naar B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondsen aan B.S, en NIH (RO1-HL128503) en The New York Stem Cell Foundation fondsen aan K.R.
100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |