In Vitro Modell av födans Angiogenes
Summary
In vitro modeller av koronar angiogenes kan utnyttjas för upptäckten av cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes. In vitro explant kulturer av sinus venosus och endokarium vävnader visar robust tillväxt som svar på VEGF-A och visa ett liknande mönster av COUP-TFII uttryck som in vivo.
Abstract
Här beskriver vi en in vitro kultur analys för att studera koronar angiogenes. Födans kärl mata hjärtmuskeln och är av klinisk betydelse. Defekter i dessa fartyg utgör allvarliga hälsorisker såsom åderförkalkning, vilket kan leda till hjärtinfarkt och hjärtsvikt hos patienter. Följaktligen är kranskärlssjukdom en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Trots sin kliniska betydelse, relativt lite framsteg har gjorts om hur man regenerera skadade kranskärl. Icke desto mindre har de senaste framstegen gjorts när det gäller att förstå de cellulära ursprung och differentieringsvägarna för utvecklingen av koronarfartyg. Tillkomsten av verktyg och teknik som gör det möjligt för forskare att fluorescerande märka stamceller, följa deras öde, och visualisera stamceller in vivo har varit avgörande för att förstå koronar fartyg utveckling. In vivo-studier är värdefulla, men har begränsningar när det gäller hastighet, tillgänglighet och flexibilitet i experimentell design. Alternativt kan exakta in vitro-modeller av koronar angiogenes kringgå dessa begränsningar och göra det möjligt för forskare att förhöra viktiga biologiska frågor med snabbhet och flexibilitet. Bristen på lämpliga in vitro-modellsystem kan ha hindrat utvecklingen av att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna för kranskärlstillväxt. Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för att odla kranskärl från sinus venosus (SV) och endokarium (Endo), de två stamtoniska vävnader som många av koronarkärlen uppstår. Vi bekräftade också att kulturerna korrekt sammanfattar några av de kända in vivo-mekanismerna. Till exempel visar vi att angiogengroddar i kultur från SV downregulate COUP-TFII uttryck liknar vad som observeras in vivo. Dessutom visar vi att VEGF-A, en välkänd angiogenic faktor in vivo, stimulerar robust angiogenes från både SV- och Endo-kulturerna. Tillsammans har vi utarbetat en korrekt in vitro kultur modell för att studera koronar angiogenes.
Introduction
Blodkärl i hjärtat kallas vanligen kranskärl. Dessa fartyg består av artärer, åder och kapillärer. Under utvecklingen, mycket grenade kapillärer upprättas först, som sedan omforma till kranskärl och vener1,2,3,4,5. Dessa inledande kapillärer är byggda av endotelstamceller som finns i proepikardium, sinus venosus (SV) och endokarium (Endo) vävnader1,6,7,8. SV är inflödesorganet i embryonala hjärta och Endo är hjärtats innerslemhinna. Endotelstamceller som finns i SV och Endo bygger majoriteten av koronarvaskulatur, medan proepikardium bidrar till en relativt liten del av det2. Den process genom vilken kapillärnätverket av kranskärl växer i hjärtat från sina befintliga prekursorceller kallas koronar angiogenes. Kranskärlssjukdom är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen och ändå saknas en effektiv behandling för denna sjukdom. Förstå detaljerade cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes kan vara användbart för att utforma nya och effektiva terapier för att reparera och regenerera skadade kranskärl.
På senare tid har en ökning av vår förståelse av hur koronarfartyg utvecklas delvis uppnåtts genom utveckling av nya verktyg och tekniker. I synnerhet har in vivo härstamningsmärkning och avancerad bildteknik varit mycket användbar för att upptäcka cellulära ursprung och differentieringsvägar för kranskärl9,10,11,12. Trots fördelarna med dessa in vivo-verktyg finns det begränsningar när det gäller snabbhet, flexibilitet och tillgänglighet. Därför kan robusta in vitro-modellsystem komplettera in vivo-system för att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna för koronar angiogenes på ett höggenomströmningssätt.
Här beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenes. Vi har utvecklat ett in vitro-odlingsodlingssystem för att odla födanskärl från två stamtorvävnader, SV och Endo. Med denna modell visar vi att in vitro-vävnaden explant kulturer växa koronar kärl groddar när stimuleras av tillväxtmedium. Dessutom växer explanta kulturer snabbt jämfört med kontroll när stimuleras av vaskulär endotel tillväxtfaktor A (VEGF-A), en mycket potent angiogenic protein. Dessutom fann vi att angiogengroddar från SV-kulturen genomgår venös dedifferentiering (förlust av COUP-TFII uttryck), en mekanism som liknar SV angiogenes in vivo1. Dessa uppgifter tyder på att in vitro explant kultursystemet troget återinför angiogenic händelser som invivo. Kollektivt, in vitro modeller av angiogenes som beskrivs här är idealiska för sondering cellulära och molekylära mekanismer för koronar angiogenes på ett hög genomströmning och tillgängligt sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Några av de mest kritiska stegen för att framgångsrikt odla kranskärl från SV- och Endo-stamtonet är: 1) Korrekt identifiera och isolera SV-vävnaden för SV-kultur; 2) Användning av ventriklar från embryon i åldern e11−11.5 för exakt Endo-kultur; 3) upprätthålla sterila förhållanden under hela dissekeringsperioden och hålla vävnaderna kalla hela tiden; och 4) hålla explantorna fästa vid ECM-belagda membranet för att undvika att vävnaden flyter i mediet.
För det första …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar medlemmarna i Sharma laboratorium för att ge en stödjande forskningsmiljö. Vi vill framföra särskilt tack till Diane (Dee) R. Hoffman som underhåller och bryr sig om vår muskoloni. Vi vill också tacka Drs. Philip J. Smaldino och Carolyn Vann för grundligt korrekturläsning manuskriptet och ge användbara kommentarer. Detta arbete stöddes av medel från Ball State University Provost Office och Institutionen för biologi till BS, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant medel till BS, och NIH (RO1-HL128503) och The New York Stem Cell Foundation medel till KR
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
Riferimenti
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
