في الجسم الحي نموذج الماوس من عدوى زرع العمود الفقري
Summary
يصف البروتوكول نموذجا جديدا في الجسم الحي لعدوى زرع العمود الفقري حيث تصاب غرسة الأسلاك الكورية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بالمكورات العنقودية الذهبية Xen36 ذات الإضاءة الحيوية. تتم مراقبة العبء البكتيري طوليا باستخدام التصوير الحيوي وتأكيده بتعداد وحدات تشكيل المستعمرات بعد القتل الرحيم.
Abstract
تنذر التهابات زرع العمود الفقري بنتائج سيئة حيث أن التشخيص يمثل تحديا والاستئصال الجراحي يتعارض مع استقرار العمود الفقري الميكانيكي. الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII) تم إنشاؤه لتوفير أداة غير مكلفة وسريعة ودقيقة في الجسم الحي لاختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري.
في هذه الطريقة ، نقدم نموذجا لجراحة العمود الفقري ذات النهج الخلفي حيث يتم نقل سلك K من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى العملية الشائكة L4 للفئران البرية C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا وتلقيحها ب 1 × 103 CFU من سلالة مضيئة بيولوجيا من بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية Xen36. ثم يتم تصوير الفئران طوليا للتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي في أيام ما بعد الجراحة 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35. يتم قياس إشارات تصوير التلألؤ الحيوي (BLI) من مجال رؤية موحد لقياس العبء البكتيري في الجسم الحي.
لتحديد كمية البكتيريا الملتصقة بالغرسات والأنسجة المحيطة بالزرع ، يتم القتل الرحيم للفئران ويتم حصاد الغرسة والأنسجة الرخوة المحيطة. يتم فصل البكتيريا عن الزرع عن طريق صوتنة ، وزرعت بين عشية وضحاها ومن ثم يتم حساب وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs). تشمل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة العد البكتيري الطولي كما تم قياسه بواسطة التلألؤ الحيوي في الجسم الحي S. aureus (متوسط التدفق الأقصى) وعدد CFU بعد القتل الرحيم.
في حين أن النماذج الحيوانية السابقة لعدوى العمود الفقري الآلية قد تضمنت تحليلا غازيا للأنسجة خارج الجسم الحي ، فإن نموذج الفئران ل SII المقدم في هذه الورقة يستفيد من التصوير البصري غير الجراحي في الوقت الفعلي في الجسم الحي للبكتيريا المضيئة بيولوجيا ليحل محل دراسة الأنسجة الثابتة. تطبيقات النموذج واسعة النطاق وقد تشمل استخدام سلالات بكتيرية بديلة ذات إضاءة حيوية ، ودمج أنواع أخرى من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف بشكل متزامن ، وتقييم الطرائق التشخيصية والعلاجية الحالية أو التحقيق في الطرائق التشخيصية والعلاجية الجديدة مثل المضادات الحيوية أو الطلاء المزروع.
Introduction
الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII). تم تصميم هذا النموذج لتوفير أداة غير مكلفة ودقيقة لتقييم تأثير متغيرات المضيف و / أو الممرض و / أو الزرع في الجسم الحي بمرونة. يهدف اختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري في هذا النموذج إلى توجيه تطوير البحث قبل التطبيق في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.
تعد العدوى المرتبطة بالزرع بعد جراحة العمود الفقري من المضاعفات المدمرة وتحدث للأسف في حوالي 3-8٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري الاختيارية1،2،3،4،5 وما يصل إلى 65٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة متعددة المستويات أو مراجعة6. غالبا ما يتطلب علاج التهابات زرع العمود الفقري دخول المستشفى عدة مرات ، وعمليات جراحية متعددة ، وعلاج بالمضادات الحيوية لفترات طويلة. تنذر SIIs بنتائج سيئة للمرضى بما في ذلك التسوية العصبية والإعاقة وزيادة خطر الوفاة. إدارة SII مكلفة للغاية ، حيث تكلف ما يزيد عن 900,000 دولار لكل مريض7.
المكورات العنقودية الذهبية هي أكثر مسببات الأمراض الخبيثة شيوعا في SII8،9،10،11. يمكن للبكتيريا أن تزرع الأعضاء مباشرة أثناء الجراحة ، أو من خلال الجرح خلال فترة ما بعد الجراحة ، أو لاحقا عن طريق انتشار الدم. في وجود غرسات معدنية ، تشكل المكورات العنقودية الذهبية غشاء حيويا يحمي البكتيريا من العلاج بالمضادات الحيوية والخلايا المناعية. في حين أن إزالة الأجهزة المصابة قد تساعد في القضاء على العدوى بشكل فعال ، إلا أن هذا غالبا ما يكون غير ممكن في العمود الفقري دون التسبب في زعزعة الاستقرار والمخاطرة بالتسوية العصبية12.
في غياب زرع الأجهزة المصابة ، هناك حاجة إلى أساليب جديدة لمنع SII واكتشافه وعلاجه. تاريخيا ، كانت هناك نماذج حيوانية محدودة من SII لتقييم سلامة وفعالية العلاجات الجديدة بكفاءة. تتطلب النماذج الحيوانية السابقة ل SII أعدادا كبيرة من الحيوانات وجمع نقاط البيانات التي تتطلب القتل الرحيم بما في ذلك عد المستعمرات والأنسجة والثقافة13،14،15. تفتقر هذه النماذج إلى المراقبة الطولية في الجسم الحي ، وتوفر نقطة بيانات واحدة فقط لكل ، وبالتالي فهي باهظة الثمن وغير فعالة.
أثبت العمل السابق الذي يدرس نموذج فأر لعدوى رأب مفاصل الركبة قيمة ودقة التصوير البصري غير الباضع في الجسم الحي لمراقبة عبء العدوى طوليا16. يسمح الكشف عن التلألؤ الحيوي بقياس العبء البكتيري على مدار زمني طولي في واحد بشكل إنساني ودقيق وفعال. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة وجود علاقة عالية بين التلألؤ الحيوي في الجسم الحي ووحدات CFU الملتصقة بالغرسات17. أدت القدرة على تتبع العدوى بمرور الوقت إلى فهم أكثر دقة للعدوى المرتبطة بالزرع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة العدوى الطولية بهذه الطريقة ، سمحت بتقييم فعالية العلاج بالمضادات الحيوية ومضادات الميكروبات الجديدة بدقة16،17،18.
بالاستفادة من هذه الأدوات ، قمنا بتطوير نموذج لعدوى زرع العمود الفقري بعد العملية الجراحية والتحقق من صحته. في الطريقة المقدمة ، نستخدم لقاحا من S. aureus Xen36 المضيئة بيولوجيا لإنشاء نموذج فأر في الجسم الحي من SII لمراقبة الحمل البكتيري طوليا16،17،18. يوفر هذا النموذج الجديد أداة قيمة لاختبار استراتيجيات الكشف والوقاية والعلاج المحتملة بكفاءة ل SII قبل تطبيقها في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنذر الالتهابات المرتبطة بالزرع في العمود الفقري بنتائج سيئة للمرضى1،2،3،4،5. على عكس العديد من المناطق الأخرى في الجسم ، لا يمكن إزالة الأجهزة المصابة في العمود الفقري بشكل متكرر بسبب خطر عدم الاستقر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يقروا باستلام كل من منحة جمعية جراحة عظام الأطفال في أمريكا الشمالية Biomet Spine Grant ومنحة معهد KL2 للمعاهد الوطنية للصحة والعلوم السريرية والانتقالية ، ومنحة HH Lee للبحوث الجراحية كمصادر تمويل رئيسية لهذه التجارب.
Materials
| Analytical Balance ME104 | Mettler Toledo | 30029067 | 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson (BD) | BD 211825 | BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) |
| Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208300 | Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord |
| Bioshield 720+ swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 75003183 | Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm |
| Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) | Branson Ultrasonics | CPX952217R | *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | Next Advance | BBY24M | The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes. |
| Germinator 500 | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211. |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Single 150L |
| IVIS Lumina X5 Imaging System | Perkin Elmer | CLS148590 | The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease. |
| MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker | Thermo Scientific | SHKE4450 | Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz |
| PBS, Phosphate Buffered Saline | Fisher Bioreagents | BP24384 | PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4 |
| Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated | Thermo Scientific | 75002436 | 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid |
| SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261 | Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz |
| Staphylococcus aureus – Xen36 | Perkin Elmer | 119243 | Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid. |
| TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V | Heidolph Tuttnauer | 23210401 | Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls |
| Tween 80 | Fisher Bioreagents | BP338-500 | Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction |
| Vortex mixer VX-200 | Labnet Internation | S0200 | 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm |
| 0.9% Sodium Chloride | Pfizer Injectables/Hospira | 00409-4888-10 | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP |
Riferimenti
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
- Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), 1460-1465 (2005).
- Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
- Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
- Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
- Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), 556-563 (2011).
- Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
- Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
- Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
- Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), 1218-1224 (2010).
- Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), 1323-1328 (2010).
- Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 149-155 (2003).
- Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
- Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), 653-656 (1998).
- Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
- Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
- Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
- Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
- Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
- Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
- Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), 406-410 (2000).
