स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के विवो माउस मॉडल में।
Summary
प्रोटोकॉल स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के विवो माउस मॉडल में एक उपन्यास का वर्णन करता है जहां एक स्टेनलेस-स्टील के-वायर इम्प्लांट बायोल्यूमिनेसेंट स्टेफिलोकोकस ऑरियस एक्सएन 36 से संक्रमित है। बैक्टीरियल बोझ की निगरानी बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के साथ अनुदैर्ध्य रूप से की जाती है और इच्छामृत्यु के बाद कॉलोनी बनाने वाली इकाई की गिनती के साथ पुष्टि की जाती है।
Abstract
स्पाइन इम्प्लांट संक्रमण खराब परिणामों को दर्शाता है क्योंकि निदान चुनौतीपूर्ण है और सर्जिकल उन्मूलन यांत्रिक रीढ़ की हड्डी की स्थिरता के विपरीत है। इस विधि का उद्देश्य स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण (एसआईआई) के एक नए माउस मॉडल का वर्णन करना है जिसे स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के लिए संभावित चिकित्सीय और उपचार रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए विवो टूल में एक सस्ती, तेज और सटीक प्रदान करने के लिए बनाया गया था।
इस विधि में, हम पश्चवर्ती-दृष्टिकोण रीढ़ की हड्डी की सर्जरी का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक स्टेनलेस-स्टील के-तार को 12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 जे जंगली-प्रकार के चूहों की एल 4 स्पिनस प्रक्रिया में स्थानांतरित किया जाता है और स्टेफिलोकोकस ऑरियस ज़ेन 36 बैक्टीरिया के बायोल्यूमिनेसेंट स्ट्रेन के 1 x 103 सीएफयू के साथ टीका लगाया जाता है। चूहों को तब पोस्ट-ऑपरेटिव दिनों 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 और 35 पर विवो में बायोल्यूमिनेसेंस के लिए अनुदैर्ध्य रूप से चित्रित किया जाता है। विवो बैक्टीरियल बोझ को मापने के लिए एक मानकीकृत क्षेत्र से बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) संकेतों को परिमाणित किया जाता है।
प्रत्यारोपण और पेरी-इम्प्लांट ऊतक का पालन करने वाले बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए, चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है और प्रत्यारोपण और आसपास के नरम ऊतक की कटाई की जाती है। बैक्टीरिया को सोनिकेशन द्वारा इम्प्लांट से अलग किया जाता है, रात भर सुसंस्कृत किया जाता है और फिर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना की जाती है। इस विधि से प्राप्त परिणामों में विवो एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंस (औसत अधिकतम प्रवाह) और इच्छामृत्यु के बाद सीएफयू गणना द्वारा मापा गया अनुदैर्ध्य जीवाणु गणना शामिल है।
जबकि इंस्ट्रूमेंटेड स्पाइन संक्रमण के पूर्व पशु मॉडल में आक्रामक, पूर्व विवो ऊतक विश्लेषण शामिल है, इस पेपर में प्रस्तुत एसआईआई का माउस मॉडल स्थिर ऊतक अध्ययन को बदलने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया के विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में गैर-आक्रामक, वास्तविक समय का लाभ उठाता है। मॉडल के अनुप्रयोग व्यापक हैं और इसमें वैकल्पिक बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल उपभेदों का उपयोग करना, मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का समकालीन अध्ययन करने के लिए अन्य प्रकार के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को शामिल करना और एंटीबायोटिकदवाओं या प्रत्यारोपण कोटिंग्स जैसे नए नैदानिक और चिकित्सीय तौर-तरीकों का मूल्यांकन करना या जांच करना शामिल हो सकता है।
Introduction
इस विधि का उद्देश्य स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण (एसआईआई) के एक नए माउस मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल को विवो में मेजबान, रोगज़नक़ और / या प्रत्यारोपण चर के प्रभाव का लचीले ढंग से आकलन करने के लिए एक सस्ती और सटीक उपकरण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस मॉडल में स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के लिए संभावित चिकित्सीय और उपचार रणनीतियों का परीक्षण बड़े पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में आवेदन से पहले अनुसंधान विकास का मार्गदर्शन करने के उद्देश्य से है।
रीढ़ की सर्जरी के बाद प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण एक विनाशकारी जटिलता है और दुर्भाग्य से वैकल्पिक रीढ़ की सर्जरी से गुजरने वाले लगभग 3-8% रोगियों में 1,2,3,4,5 और बहुस्तरीय यासंशोधन सर्जरी से गुजरने वाले 65% रोगियों में होताहै। स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के उपचार के लिए अक्सर कई अस्पताल में भर्ती, कई सर्जरी और लंबे समय तक एंटीबायोटिक थेरेपी की आवश्यकता होती है। एसआईआई न्यूरोलॉजिकल समझौता, विकलांगता और मृत्यु दर के बढ़ते जोखिम सहित खराब रोगी परिणामों को दर्शाता है। एसआईआई का प्रबंधन बेहद महंगा है, जिसकी लागत प्रति रोगी$ 900,000 से ऊपर है।
स्टेफिलोकोकस ऑरियस एसआईआई 8,9,10,11 का सबसे आम विषैला रोगज़नक़ है। बैक्टीरिया सर्जरी के दौरान सीधे हार्डवेयर को बीज दे सकते हैं, पोस्टऑपरेटिव अवधि के दौरान घाव के माध्यम से, या बाद में हेमटोजेनस प्रसार के माध्यम से। धातु प्रत्यारोपण की उपस्थिति में, एस ऑरियस बायोफिल्म बनाता है जो बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक थेरेपी और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बचाता है। जबकि संक्रमित हार्डवेयर को हटाने से संक्रमण को प्रभावी ढंग से मिटाने में मदद मिल सकती है, यह अक्सर अस्थिरता पैदा किए बिना रीढ़ की हड्डी में संभव नहीं होता है और न्यूरोलॉजिकल समझौता12 का खतरा होता है।
संक्रमित हार्डवेयर की खोज की अनुपस्थिति में, एसआईआई को रोकने, पता लगाने और इलाज करने के लिए नए दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। ऐतिहासिक रूप से, नए उपचारों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक आकलन करने के लिए एसआईआई के सीमित पशु मॉडल रहे हैं। एसआईआई के पिछले पशु मॉडल में बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है और कॉलोनी गिनती, हिस्टोलॉजी और संस्कृति13,14,15 सहित इच्छामृत्यु की आवश्यकता वाले डेटा बिंदुओं के संग्रह की आवश्यकता होती है। विवो निगरानी में अनुदैर्ध्य की कमी, ये मॉडल प्रति जानवर केवल एक डेटा बिंदु प्रदान करते हैं और इसलिए महंगे और अक्षम हैं।
घुटने के आर्थ्रोप्लास्टी संक्रमण के एक माउस मॉडल का अध्ययन करने वाले पिछले काम ने संक्रमणके बोझ की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में नॉनइनवेसिव के मूल्य और सटीकता को स्थापित किया। बायोल्यूमिनेसेंस का पता लगाने से बैक्टीरिया के बोझ को एक ही जानवर में एक अनुदैर्ध्य समय पाठ्यक्रम में मानवीय, सटीक और कुशलता से निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, पूर्व अध्ययनों ने विवो बायोल्यूमिनेसेंस और प्रत्यारोपणके अनुरूप सीएफयू के बीच एक उच्च सहसंबंध का प्रदर्शन किया है। समय के साथ संक्रमण को ट्रैक करने की क्षमता ने प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण की अधिक बारीक समझ पैदा की है। इसके अलावा, इस तरह से अनुदैर्ध्य संक्रमण की निगरानी ने एंटीबायोटिक थेरेपी और नोवेल एंटीमाइक्रोबियल की प्रभावशीलता का सटीक मूल्यांकन करने की अनुमति दी है16,17,18.
इन उपकरणों का लाभ उठाते हुए, हमने पोस्टऑपरेटिव स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण का एक मॉडल विकसित और मान्य किया। प्रस्तुत विधि में, हम बैक्टीरियल बोझ16,17,18 की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए एसआईआई के इनविवो माउस मॉडल को स्थापित करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट एस ऑरियस ज़ेन 36 के एक इनोकुलम का उपयोग करते हैं। यह नया मॉडल बड़े पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में उनके आवेदन से पहले एसआईआई के लिए संभावित पहचान, रोकथाम और उपचार रणनीतियों का कुशलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण 1,2,3,4,5 रोगियों के लिए खराब परिणाम दिखाते हैं। शरीर के कई अन्य क्षेत्रों के विपरीत, अस्थिरत?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इन प्रयोगों के लिए प्रमुख वित्त पोषण स्रोतों के रूप में बाल चिकित्सा आर्थोपेडिक सोसाइटी ऑफ नॉर्थ अमेरिका बायोमेट स्पाइन ग्रांट और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट केएल 2 ग्रांट और एचएच ली सर्जिकल रिसर्च ग्रांट दोनों की प्राप्ति को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Analytical Balance ME104 | Mettler Toledo | 30029067 | 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson (BD) | BD 211825 | BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) |
| Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208300 | Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord |
| Bioshield 720+ swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 75003183 | Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm |
| Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) | Branson Ultrasonics | CPX952217R | *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | Next Advance | BBY24M | The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes. |
| Germinator 500 | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211. |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Single 150L |
| IVIS Lumina X5 Imaging System | Perkin Elmer | CLS148590 | The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease. |
| MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker | Thermo Scientific | SHKE4450 | Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz |
| PBS, Phosphate Buffered Saline | Fisher Bioreagents | BP24384 | PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4 |
| Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated | Thermo Scientific | 75002436 | 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid |
| SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261 | Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz |
| Staphylococcus aureus – Xen36 | Perkin Elmer | 119243 | Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid. |
| TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V | Heidolph Tuttnauer | 23210401 | Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls |
| Tween 80 | Fisher Bioreagents | BP338-500 | Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction |
| Vortex mixer VX-200 | Labnet Internation | S0200 | 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm |
| 0.9% Sodium Chloride | Pfizer Injectables/Hospira | 00409-4888-10 | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP |
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