In vivo-musmodell av ryggradsimplantatinfektion

Summary

Protokollet beskriver en ny in vivo-musmodell av ryggradsimplantatinfektion där ett k-trådimplantat av rostfritt stål infekteras med bioluminescerande Staphylococcus aureus Xen36. Bakteriebördan övervakas longitudinellt med bioluminescerande avbildning och bekräftas med antal kolonibildande enheter efter avlivning.

Abstract

Infektioner i ryggradsimplantat förebådar dåliga resultat eftersom diagnosen är utmanande och kirurgisk utrotning står i strid med den mekaniska ryggradsstabiliteten. Syftet med denna metod är att beskriva en ny musmodell av ryggradsimplantatinfektion (SII) som skapades för att ge ett billigt, snabbt och exakt in vivo-verktyg för att testa potentiella terapier och behandlingsstrategier för ryggradsimplantatinfektioner.

I denna metod presenterar vi en modell av ryggradskirurgi med bakre tillvägagångssätt där en k-tråd av rostfritt stål transfixeras i L4-spinös process hos 12 veckor gamla C57BL/6J vildtypsmöss och inokuleras med 1 x 10³ CFU av en bioluminescerande stam av Staphylococcus aureus Xen36-bakterier. Möss avbildas sedan longitudinellt för bioluminiscens in vivo på postoperativa dagar 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 och 35. Bioluminiscensavbildningssignaler (BLI) från ett standardiserat synfält kvantifieras för att mäta bakteriell belastning in vivo.

För att kvantifiera bakterier som sitter fast på implantat och peri-implantatvävnad avlivas möss och implantatet och omgivande mjukvävnad skördas. Bakterier lossnar från implantatet genom ultraljudsbehandling, odlas över natten och sedan kolonibildande enheter (CFU) räknas. Resultaten från denna metod inkluderar longitudinella bakterieräkningar mätt med in vivo S. aureus bioluminiscens (genomsnittligt maximalt flöde) och CFU-räkningar efter avlivning.

Medan tidigare djurmodeller av instrumenterad ryggradsinfektion har involverat invasiv, ex vivo vävnadsanalys, utnyttjar musmodellen av SII som presenteras i denna artikel icke-invasiv, realtids in vivo optisk avbildning av bioluminescerande bakterier för att ersätta statisk vävnadsstudie. Tillämpningar av modellen är breda och kan innefatta användning av alternativa bioluminescerande bakteriestammar, inkorporering av andra typer av genetiskt modifierade möss för att samtidigt studera värdens immunsvar och utvärdering av nuvarande eller undersökning av nya diagnostiska och terapeutiska modaliteter såsom antibiotika eller implantatbeläggningar.

Introduction

Syftet med denna metod är att beskriva en ny musmodell av ryggradsimplantatinfektion (SII). Denna modell utformades för att ge ett billigt och exakt verktyg för att flexibelt bedöma effekten av värd-, patogen- och/eller implantatvariabler in vivo. Att testa potentiella terapier och behandlingsstrategier för ryggradsimplantatinfektioner i denna modell syftar till att vägleda forskningsutvecklingen innan den tillämpas i större djurmodeller och kliniska prövningar.

Implantatrelaterad infektion efter ryggkirurgi är en förödande komplikation och förekommer tyvärr hos cirka 3–8 % av patienterna som genomgår elektiv ryggkirurgi 1,2,3,4,5 och upp till 65 % av patienterna som genomgår flernivå- eller revisionskirurgi 6. Behandling av ryggradsimplantatinfektioner kräver ofta flera sjukhusvistelser, flera operationer och långvarig antibiotikabehandling. SII:er förebådar dåliga patientresultat, inklusive neurologiska komprometteringar, funktionshinder och en ökad risk för dödlighet. Hanteringen av SII är extremt dyr och kostar uppemot 900 000 dollar per patient⁷.

Staphylococcus aureus är den vanligaste virulenta patogenen av SII 8,9,10,11. Bakterier kan fröa hårdvaran direkt under operationen, genom såret under den postoperativa perioden eller senare via hematogen spridning. I närvaro av metallimplantat bildar S. aureus biofilm som skyddar bakterierna från antibiotikabehandling och immunceller. Även om avlägsnande av infekterad hårdvara kan hjälpa till att effektivt utrota en infektion, är detta ofta inte möjligt i ryggraden utan att orsaka destabilisering och riskera neurologisk kompromettering¹².

I avsaknad av explantation av infekterad hårdvara behövs nya metoder för att förebygga, upptäcka och behandla SII. Historiskt sett har det funnits begränsade djurmodeller av SII för att effektivt bedöma säkerheten och effekten av nya terapier. Tidigare djurmodeller av SII kräver ett stort antal djur och insamling av datapunkter som kräver avlivning inklusive koloniräkning, histologi och odling^13,14,15. Eftersom dessa modeller saknar longitudinell in vivo-övervakning ger de bara en datapunkt per djur och är därför dyra och ineffektiva.

Tidigare arbete med att studera en musmodell av knäprotesinfektion fastställde värdet och noggrannheten av icke-invasiv optisk avbildning in vivo för att longitudinellt övervaka infektionsbörda¹⁶. Detektionen av bioluminiscens gör det möjligt att kvantifiera bakteriebelastningen under ett longitudinellt tidsförlopp i ett enda djur på ett humant, exakt och effektivt sätt. Dessutom har tidigare studier visat en hög korrelation mellan bioluminiscens in vivo och CFU:er som är fästa vid implantat¹⁷. Förmågan att spåra infektion över tid har lett till en mer nyanserad förståelse av implantatrelaterad infektion. Övervakning av longitudinella infektioner på detta sätt har dessutom gjort det möjligt att noggrant bedöma effektiviteten av antibiotikabehandling och nya antimikrobiella medel^16,17,18.

Med hjälp av dessa verktyg utvecklade och validerade vi en modell för postoperativ ryggradsimplantatinfektion. I den presenterade metoden använder vi ett inokulum av bioluminescerande S. aureus Xen36 för att etablera en in vivo-musmodell av SII för att longitudinellt övervaka bakteriell börda^16,17,18. Denna nya modell ger ett värdefullt verktyg för att effektivt testa potentiella detektions-, preventions- och behandlingsstrategier för SII innan de tillämpas i större djurmodeller och kliniska prövningar.

Protocol

Alla djur hanterades i strikt överensstämmelse med god djursed enligt definitionen i de federala bestämmelserna i Animal Welfare Act (AWA), 1996 års guide för vård och användning av försöksdjur, PHS policy för human vård och användning av försöksdjur, samt institutionens riktlinjer och förfaranden som anges i Animal Care and Use Training Manual, och allt djurarbete godkändes av University of California Los Angeles Chancellor’s Animal Research Committee (ARC). 1. Val av biolumine…

Representative Results

Proceduren som presenteras här användes för att bedöma effekten av antibiotikaregimer i en in vivo-musmodell av SII. Specifikt jämfördes effekten av en kombination av vankomycin och rifampicin antibiotikabehandling med vankomycin som monoterapi och obehandlade infekterade kontroller. Före operationen randomiserades mössen till antingen kombinationsbehandling, monoterapi eller infekterad kontroll. En statistisk effektanalys utfördes för att beräkna urvalsstorleken. Förväntade medel…

Discussion

Implantatrelaterade infektioner i ryggraden förebådar dåliga resultat för patienter 1,2,3,4,5. Till skillnad från många andra områden i kroppen kan infekterad hårdvara i ryggraden ofta inte tas bort på grund av risken för instabilitet och neurologisk kompromettering. Denna unika utmaning när det gäller biofilmsbakterier som är resistenta mot syste…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP