Vi præsenterer et robust, overførbart og prædiktivt in vitro eksponeringssystem til screening og overvågning af luftbårne partikler vedrørende deres akutte lungecytotoksicitet ved at udsætte dyrkede menneskelige lungeceller på luftflydende interface (ALI).
Her præsenterer vi et specielt designet modulopbygget in vitro eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af dyrkede menneskelige lungeceller på ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks cigaretrøg), hvilket giver realistiske fysiologiske eksponering af den menneskelige alveolærs apiske overflade for luft. I modsætning til sekventielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolvejledning opfylder det modulære design af radiale flowsystem alle krav til kontinuerlig generering og transport af testatmosfæren til cellerne, en homogen fordeling og aflejring af partiklerne og den fortsatte fjernelse af atmosfæren. Denne eksponeringsmetode er primært beregnet til at blive eksponeret for celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen af flydende aerosoler og meget giftige og aggressive gasser afhængigt af aerosolproduktionsmetoden og eksponeringsmodulernes materiale .
Inden for rammerne af en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse blev dette eksponeringssystem bevist som en overførbar, reproducerbar og prædiktiv screeningsmetode til kvalitativ vurdering af luftbårne partiklers akutte lungecytotoksicitet, hvorved luftbårne partikler blev vurderet, potentielt reducere eller erstatte dyreforsøg, som normalt ville give denne toksikologiske vurdering.
Indånding af giftige luftbårne partikler er et folkesundhedsproblem, der fører til en lang række sundhedsrisici på verdensplan og mange millioner dødsfald årligt1,2. Klimaændringer, den igangværende industrielle udvikling og den stigende efterspørgsel efter energi, landbrug og forbrugsvarer har bidraget til stigningen i lungesygdomme i de seneste år3,4,5,6. Viden om og evaluering af inhalerbare stoffer vedrørende deres akutte toksicitet ved indånding danner grundlag for risikovurdering og risikostyring, men disse oplysninger mangler stadig for en lang række af disse stoffer7,8. Siden 2006 har EU’s kemikalielovgivning Reach (Registrering, Evaluering, Autorisation og Begrænsning af Kemikalier) kræves, at allerede eksisterende og nyindførte produkter underkastes en toksikologisk karakterisering, herunder inhalationsvejen, før de markedsføres. Reach fokuserer derfor på alternative og animalske metoder, gennemførelse af “3R”-princippet (erstatning, raffinement og reduktion af dyreforsøg) og anvendelse af passende in vitro-modeller9. I de seneste år er der udviklet mange forskellige og tilstrækkelige modeller til test af inhalationstoksicitet uden for dyr (f.eks. in vitrocellekulturer, lunge-on-a-chip-modeller, præcisionssnitilungeskiver (PCLS)) for at vurdere den akutte toksicitet ved indånding af luftbårne partikler5,7,10,11. Med hensyn til in vitrocellekulturmodeller kan dyrkede celler eksponeres under neddykkede forhold eller ved ALI (figur 1). Gyldigheden af undersøgelser af neddykket eksponering er imidlertid begrænset med hensyn til vurderingen af toksiciteten af luftbårne forbindelser, især partikler. Nedsænket eksponeringsteknikker svarer ikke til den menneskelige in vivo-situation cellekulturmediet, der dækker cellerne, kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og dermed de toksiske egenskaber ved et teststof12,13. ALI in vitro inhalation modeller tillader direkte eksponering af celler til teststoffer uden indblanding af cellekultur medium med testpartikler, således efterligne menneskers eksponering med højere fysiologiske og biologiske lighed end neddykket eksponering12,14.
For reguleringsprocesser som REACH er der imidlertid kun tilgængelige dyremodeller inden for akut inhalationstoksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder indtil videre er blevet tilstrækkeligt valideret og officielt accepteret indtil videre14. Med henblik herpå skal testmodellervalideres i overensstemmelse med kravene i Eu’s referencelaboratorium for alternativer til dyreforsøg (EURL-ECVAM) om testgyldighed15.
En tidligere prævalideringsundersøgelse og en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse viste med succes anvendelsesområdet for CULTEX RFS-eksponeringssystemet og dets overførsel, stabilitet og reproducerbarhed13. Dette eksponeringssystem er et in vitro-cellebaseret eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. cigaretrøg) ved ALI på grund af dets radiale aerosoldistributionskoncept og udførelsen af testaerosolet i et kontinuerligt flow over cellerne16. Grundmodulet i dette radiale flowsystem består af indløbsadapteren, aerosolets styremodul med en radial aerosolfordeling, prøvetagnings- og stikmodulet og et låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererede partikler når cellerne via indløbsadapteren og aerosolstyremodulet og deponeres på cellekulturindsatserne, som er placeret i prøvetagningsmodulets tre radialt arrangerede eksponeringskamre. Aerosolets styremodul samt prøvetagningsmodulet kan opvarmes ved at tilslutte sig et eksternt vandbad17.
Inden for rammerne af begge undersøgelser blev der anvendt A549-celler til alle eksponeringsforsøg. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje, der er meget velkarakteriseret og har været brugt som in vitro-model for type II alveolar epitelceller i talrige toksikologiske undersøgelser. Cellerne er karakteriseret ved lamellar organer, produktion af overfladeaktive stof og en række inflammation-relevante faktorer18. De viser også egenskaber bronkial epitelceller på grund af deres slim produktion19. Desuden kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinje er mangelfuld i opbygningen af celle-celle kontakter, dyrkning af disse celler er langt mere praktisk, billigere og resultater afledt heraf er donor-uafhængige i forhold til primære celler20.
A549 celler blev seedet i 6-brøndcellekultur skær (PET membran, 4,67 cm2, pore størrelse 0,4 mm) med en tæthed på 3,0 x 105 celler pr indsætte og dyrket i 24 timer under neddykkede forhold. Celler blev derefter eksponeret i tre uafhængige laboratorier for ren luft og tre forskellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2) af 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosis korreleres med aflejringstiden, hvilket resulterer i en konstant partikelhastighed på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellerne efter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. De deponerede partikler blev dog ikke vasket af efter aflejring, men forblev på cellerne i 24 timer. Partiklernes aflejringstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen af cellerne varede i 24 timer i alt. Teststoffernes depositionrate blev fastsat ved indledende forsøg efter tidligere metoder17.
Cellelevedygtigheden som indikator for toksicitet blev vurderet 24 timer efter partikelaflejring ved hjælp af en cellelevedygtighedsanalyse. Der blev sat særlig fokus på kvaliteten af ren luftkontrol, optimering og forfinelse af eksponeringsprotokollen, intra- og interlaboratoriereproducerbarheden og etablering af en forudsigelsesmodel (PM). Stoffer, der førte til et fald i cellelevedygtigheden på under 50 % (PM 50 %) eller 75% (PM 75%) ved en af de tre eksponeringsdoser blev anset for at have en akut inhalationsfare. Resultaterne blev derefter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (baseret på mindst én pålidelig undersøgelse ifølge OECD’s testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), hvilket førte til en samlet overensstemmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % og en følsomhed på 88 %23.
Ud over måling af cellelevedygtighed kan andre endepunkter såsom cytokinfrigivelse, undersøgelse af cellelysate- eller membranintegriteten via LDH-analyse vurderes, men var ikke påkrævet til valideringsundersøgelsen. Eksponeringssystemet (f.eks. Følgende protokol anbefales til eksponeringsforsøg med luftbårne partikler ved hjælp af dette eksponeringssystem.
Mange modeller for toksicitetstest for indånding af indånding uden for dyr er blevet udviklet i de senere år for at få oplysninger om den akutte fare for indånding af partikler, der kan inhaleres, og for at reducere og erstatte dyreforsøg i henhold til 3R-princippet25.
Med hensyn til cellekultur modeller, eksponering af celler kan ske under neddykkede forhold eller på ALI. Udsætter celler under neddykkede forhold kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og derm…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprojekt A-D)) og af Den Tyske Forskningsfond (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsuddannelsesgruppe GRK 2338).
Cells | |||
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Cell culture medium and supplies | |||
DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
Cell culture material | |||
CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
Chemicals | |||
CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
Instruments + equipment | |||
CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX supply | |||
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |