Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall'aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI).
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Articolo metodologico
Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui presentiamo un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all'ALI a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta), fornendo così un realistico l'esposizione della superficie apicale della regione alveolare umana all'aria. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare del sistema a flusso radiale soddisfa tutti i requisiti per la generazione continua e il trasporto dell'atmosfera di prova alle cellule, una distribuzione omogenea e la deposizione di le particelle e la continua rimozione dell'atmosfera. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione delle cellule alle particelle trasportate dall'aria, ma può essere adattato all'esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione .
Nell'ambito di uno studio di convalida recentemente completato, questo sistema di esposizione si è dimostrato un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall'aria, potenzialmente riducendo o sostituendo esperimenti sugli animali che normalmente fornirebbeno questa valutazione tossicologica.
Introduzione
L'inalazione di particelle atmosferiche tossiche è un problema di salute pubblica, che porta a una moltitudine di rischi per la salute in tutto il mondo e molti milioni di morti ogni anno1,2. Il cambiamento climatico, lo sviluppo industriale in corso e la crescente domanda di energia, prodotti agricoli e di consumo hanno contribuito all'aumento delle malattie polmonari negli ultimi anni3,4,5,6. La conoscenza e la valutazione delle sostanze inalabili per quanto riguarda la loro tossic....
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Protocollo
NOTA: il protocollo di un esperimento di esposizione copre un periodo di tre giorni.
Giorno 1
1. Preparati generali e coltivazione di cellule
NOTA: La linea cellulare epiteliale polmonare umana A549 è stata utilizzata per esperimenti di esposizione. Le cellule devono essere maneggiate in condizioni sterili. Possono essere utilizzate altre linee cellulari adatte per la coltivazione all'ALI.
- Preparare il mezzo di crescita (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e 5 g/mL di gentilcina) e il mezzo di esposizione (DMEM, integr....
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Risultati
Il CULTEX RFS è un sistema modulare di esposizione in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule all'ALI. Nell'ambito di un precedente studio di pre-convalida, l'applicabilità generale di questo sistema di esposizione e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità sono state dimostrate con successo. In un recente progetto di ricerca finanziato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca, il sistema di esposizione è s.......
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Discussione
Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli di test di tossicità per l'inalazione non animale al fine di ottenere informazioni sul rischio di inalazione acuta delle particelle inalabili e per ridurre e sostituire gli esperimenti sugli animali secondo il principio 3R25.
In termini di modelli di coltura cellulare, l'esposizione delle cellule può essere effettuata in condizioni sommerse o all'ALI. Esporre le cellule in condizioni sommerse può influenzare le propr.......
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Dichiarazioni
Gli autori AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT e DS non hanno nulla da rivelare. L'azienda Cultex Technology GmbH (precedentemente Cultex Laboratories GmbH) produce strumenti (ad esempio, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizzati in questo articolo. NM è stato un dipendente di Cultex Laboratories GmbH durante questo studio. OK è un dipendente di Cultex Technology GmbH (ex Cultex Laboratories GmbH). Il brevetto PCT/EP2009/007054 per il dispositivo è tenuto dal fondatore della Cultex Technology GmbH Prof.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Germania (Grant 031A581, sub-progetto A-D)) e dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Ricerca Training Group GRK 2338).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Terreno di coltura cellulare e forniture | |||
| DMEM | Biochrom, Berlino, Germania | FG 0415 | utilizzato come terreno di crescita |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germania | 22320 | utilizzato come mezzo di esposizione |
| FBS superior | Biochrom, Berlino, Germania | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlino, Germania | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germania | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlino, Germania | L 1825 | |
| Tripsina/EDTA (0,05%/0,02%) | Biochrom, Berlino, Germania | L 2143 | |
| Materiale per colture cellulari | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germania | REF 05651794 | |
| Piastre per colture cellulari | Corning, Wiesbaden, Germania | 3516 | Piastre a 6 pozzetti |
| Corning Inserti per colture cellulari Transwell | Corning, Wiesbaden, Germania | 3450 | Inserti da 24 mm; 6-&timido; piastre a pozzetti; 0,4 µ m |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germania | REF 05651808001 | |
| Aria compressa (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Germania | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, Regno Unito | ab155902 | |
| Strumenti + apparecchiature | |||
| CASY Cell Counter | Schä rfe System GmbH, Reutlingen, Germania | ||
| Termostato di circolazione | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Germania | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Pressa idraulica | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Germania | ||
| Manicotto d'inserimento CULTEX | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Germania | ||
| CULTEX RFS - Sistema a flusso radiale Tipo 2 (modulo per l'esposizione di particelle) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Germania | ||
| CULTEX RFS - Sistema a flusso radiale Tipo 2 (modulo per l'esposizione all'aria pulita) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply Regolatore di | |||
| flusso 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Regolatore di flusso 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filtri (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germania | LP-050 | Munktell Filtro sterile; Efficienza di ritenzione delle particelle > 99,999% |
| Filtri (piccoli) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germania | 9933-05-DQ | Filtro monouso Balston |
| Pompa media | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germania | peristaltica digitale | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser |
| micropiastre Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germania | ||
| Pompa Vakuum | KNF, Friburgo, Germania | N86 KT.18 | |
| Vö regolatore di portata massica gtlin 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vö gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Bagno d'acqua | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Germania | Ecoline Staredition RE 104 |
Riferimenti
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
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Ristampe e permessi
