Hava-sıvı arabiriminde (ALI) ekili insan akciğer hücrelerini teşhir ederek, akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili havapartiküllerinin taranması ve izlenmesi için sağlam, aktarılabilir ve tahmine dayalı bir in vitro maruziyet sistemi salıyoruz.
Burada, ALI’de ekili insan akciğer hücrelerinin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro maruziyet sistemi sunarak gerçekçi fizyolojik insan alveolar bölgenin apikal yüzeyinin havaya maruz kalma. Lineer aerosol kılavuzlu sıralı pozlama modellerinin aksine, radyal akış sisteminin modüler tasarımı, test atmosferinin hücrelere sürekli üretimi ve taşınması için tüm gereksinimleri karşılar, homojen bir dağılım ve parçacıklar ve atmosferin sürekli kaldırılması. Bu maruz kalma yöntemi öncelikle havadaki parçacıklara hücrelerin maruz kalma için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi ve maruziyet modüllerinin malzeme bağlı olarak sıvı aerosoller ve son derece toksik ve agresif gazların maruz kalma adapte edilebilir .
Yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması çerçevesinde, bu maruziyet sistemi, havadaki parçacıkların akut pulmoner sitotoksisitesinin nitel değerlendirmesi için aktarılabilir, tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tarama yöntemi olarak kanıtlanmıştır, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirmeyi sağlayacak hayvan deneylerini potansiyel olarak azaltmak veya değiştirmek.
Toksik havadan bulaşan parçacıkların solunması bir halk sağlığı sorunudur, dünya çapında sağlık riskleri çok sayıda yol ve ölümler milyonlarca yıllık1,2. İklim değişikliği, devam eden endüstriyel gelişme ve artan enerji talebi, tarım ve tüketici ürünleri son yıllarda akciğer hastalıklarının artmasına katkıda bulunmuştur3,4,5,6. Bilgi ve akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili solunabilir maddelerin değerlendirilmesi tehlike değerlendirmesi ve risk yönetimi için temel sağlamak, ancak bu bilgiler hala bu maddelerin geniş bir yelpazede için eksik7,8. 2006 yılından bu yana, AB kimyasal mevzuatı REACH (Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, Yetkilendirilmesi ve Kısıtlanması) mevcut ve yeni tanıtılan ürünlerin piyasaya sürülmeden önce soluma rotası da dahil olmak üzere toksikolojik bir karakterizasyondan geçmesini gerektirmektedir. Bu nedenle REACH, alternatif ve hayvansız yöntemlere, “3R” prensibinin uygulanmasına (Hayvan deneylerinin değiştirilmesi, İncelmesi ve azaltılması) ve uygun in vitro modellerin in vitro modellerinin kullanımına odaklanmaktadır9. Son yıllarda, birçok farklı ve yeterli hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri (örneğin, in vitro hücre kültürleri, akciğer-on-a-chip modelleri, hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS)) amacıyla hava daki parçacıkların akut inhalasyon toksisitesi değerlendirmek için geliştirilmiştir5,7,10,11. In vitro hücre kültürü modelleri açısından, ekili hücreler batık koşullarda veya ALI’de maruz kalınabilir (Şekil 1). Ancak, batık maruziyet çalışmalarının geçerliliği, özellikle partiküllerin havadaki bileşiklerin toksisitesinin değerlendirilmesi açısından sınırlıdır. Batık maruzkalma teknikleri in vivo durumuna karşılık gelmez; hücreleri kapsayan hücre kültürü orta fiziko-kimyasal özellikleri etkileyebilir ve böylece, bir test maddesinin toksik özellikleri12,13. ALI in vitro inhalasyon modelleri test parçacıkları ile hücre kültürü ortamının müdahalesi olmadan test maddeleri hücrelerin doğrudan maruz kalma sağlar, böylece, batık pozlama daha yüksek fizyolojik ve biyolojik benzerlik ile insan maruziyeti taklit12,14.
REACH gibi düzenleyici işlemler için, ancak, sadece hayvan modelleri akut inhalasyon toksikoloji alanında mevcuttur, hiçbir alternatif in vitro yöntemleri yeterince doğrulanmış ve resmen şimdiye kadar kabul edilmiştir14. Bu amaçla test modellerinin, test geçerliliğine ilişkin Hayvan TestleriNe Alternatifler Için Avrupa Birliği Referans Laboratuvarı (EURL-ECVAM) ilkelerinin gereklerine göre doğrulanması gerekir15.
Eski bir ön doğrulama çalışması ve yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması cultex RFS maruz kalma sisteminin uygulama alanını ve aktarılabilirliğini, stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini başarıyla göstermiştir13. Bu maruz kalma sistemi, radyal aerosol dağılım konsepti ve test aerosolünün hücreler üzerinde sürekli bir akış halinde iletimi nedeniyle ALI’de hücrelerin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan in vitro hücre tabanlı bir maruz kalma sistemidir16. Bu radyal akış sisteminin temel modülü giriş adaptörü, radyal aerosol dağılımına sahip aerosol kılavuz modülü, numune alma ve soket modülü ve el tekerleği ile kilitleme modülünden oluşur (Şekil 2). Oluşturulan parçacıklar giriş adaptörü ve aerosol kılavuz modülü aracılığıyla hücrelere ulaşır ve örnekleme modülünün radyal olarak düzenlenmiş üç pozlama odasında bulunan hücre kültürü kesici uçlarda birikir. Aerosol kılavuz modülü ve örnekleme modülü harici bir su banyosuna bağlanarak ısıtılabilir17.
Her iki çalışma çerçevesinde tüm maruzkalma deneyleri için A549 hücreleri kullanılmıştır. Hücre hattı A549 çok iyi karakterize ve çok sayıda toksikolojik çalışmalarda tip II alveoler epitel hücreleri için bir in vitro model olarak kullanılmıştır bir insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattıdır. Hücreler lamellar cisimler ile karakterizedir, sürfaktan üretimi ve inflamasyon ile ilgili faktörlerin bir dizi18. Ayrıca mukus üretimi nedeniyle bronşiyal epitel hücrelerinin özelliklerini göstermek19. Ayrıca, ONLAR ALI kültürlü olabilir. Bu hücre hattı hücre-hücre temasları bina eksik olmasına rağmen, bu hücrelerin ekimi çok daha uygun, daha az maliyet pahalı ve bunların elde edilen sonuçlar birincil hücrelere göre donör bağımsız20.
A549 hücreleri 6 kuyulu hücre kültürü kesici uçlarda (PET membran, 4.67 cm2, gözenek boyutu 0.4 mm) seri başı 3.0 x 105 hücre yoğunluğu ile tohumlanmış ve batık koşullarda 24 saat ekili olarak eklenmiştir. Hücreler daha sonra havayı temizlemek için üç bağımsız laboratuvarda maruz kaldı ve ALI’de 20 test maddesinden üç farklı maruz kalma dozu (25, 50 ve 100 μg/cm2)alındı. Pozlama dozu, sırasıyla 15, 30 veya 60 dakika sonra hücrelere 25 g/cm2,50 μg/cm2 ve 100 g/cm2 sabit partikül oranı ile sonuçlanan biriktirme süresi ile ilişkilidir. Ancak biriken parçacıklar birikmeden sonra yıkanmamış, ancak 24 saat boyunca hücrelerde kalmıştır. Bu nedenle parçacıkların biriktirme süreleri 15, 30 ve 60 dk idi, ancak hücrelerin maruz kalma toplam 24 saat sürdü. Test maddelerinin biriktirme oranı önceki yöntemlere göre ön deneylerdebelirlenmiştir 17.
Toksisitenin bir göstergesi olarak hücre canlılığı, hücre canlılığı tsayı kullanılarak parçacık birikiminden 24 saat sonra değerlendirildi. Temiz hava kontrollerinin kalitesi, maruz kalma protokolünün optimizasyonu ve iyileştirilmesi, laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik ve bir tahmin modelinin (PM) oluşturulması üzerine özel bir odak noktası kurulmuştur. Hücre canlılığının %50’nin altına düşmesine yol açan maddeler (PM %50) veya %75 (PM %75) herhangi üç maruz kalma dozlarında akut inhalasyon tehlikesi uygulamak için kabul edildi. Sonuçlar daha sonra mevcut in vivo verileri ile karşılaştırıldı (OECD test kılavuzuna göre en az bir güvenilir çalışma dayalı (TG) 403 veya TG 43621,22), genel bir uyum yol 85%, bir özgüllük ile 83% ve 88%23duyarlılık .
Hücre canlılığının ölçülmesinin yanı sıra, sitokin salınımı, ldh tetkik yoluyla hücre lisatının incelenmesi veya membran bütünlüğünün incelenmesi gibi diğer uç noktalar değerlendirilebilir ancak doğrulama çalışması için gerekli değildir. Böylece, maruz kalma sistemi (örneğin, CULTEX RFS) test edilen hava partiküllerinin akut inhalasyon toksisitesinin nitel değerlendirilmesi için bir tahmine dayalı tarama sistemi olarak kanıtlanmıştır, hayvan testleri için umut verici bir alternatif yöntem temsil. Bu pozlama sistemini kullanarak havadaki parçacıklara maruz kalma deneyleri için aşağıdaki protokol önerilir.
Birçok hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri son yıllarda inhale edilebilir parçacıkların akut inhalasyon tehlikesi hakkında bilgi edinmek ve 3R prensibine göre hayvan deneylerini azaltmak ve değiştirmek amacıyla geliştirilmiştir25.
Hücre kültürü modelleri açısından, hücrelerin maruz kalma batık koşullar altında veya ALI yapılabilir. Batık koşullar altında hücrelerin maruz fiziko-kimyasal özellikleri ve böylece, bir test madde…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Almanya (Grant 031A581, alt proje A-D)) ve Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Araştırma Eğitim Grubu GRK 2338).
Cells | |||
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Cell culture medium and supplies | |||
DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
Cell culture material | |||
CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
Chemicals | |||
CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
Instruments + equipment | |||
CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX supply | |||
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |