Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle
Summary
Wir präsentieren ein robustes, übertragbares und prädiktives In-vitro-Expositionssystem für das Screening und die Überwachung von Partikeln in der Luft hinsichtlich ihrer akuten lungenzytotoxizität durch die Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI).
Abstract
Hier präsentieren wir ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die homogene Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen am ALI gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z.B. Zigarettenrauch) ermöglicht und somit eine realistische physiologische Exposition der apikalen Oberfläche des menschlichen Alveolarbereichs gegenüber Luft. Im Gegensatz zu sequenziellen Belichtungsmodellen mit linearer Aerosolführung erfüllt der modulare Aufbau des Radialstromsystems alle Anforderungen an die kontinuierliche Erzeugung und den Transport der Prüfatmosphäre zu den Zellen, eine homogene Verteilung und partikelund die kontinuierliche Entfernung der Atmosphäre. Diese Expositionsmethode ist in erster Linie für die Exposition von Zellen gegenüber Partikeln in der Luft konzipiert, kann aber je nach Aerosolerzeugungsmethode und Material der Expositionsmodule an die Exposition von flüssigen Aerosolen und hochgiftigen und aggressiven Gasen angepasst werden. .
Im Rahmen einer kürzlich abgeschlossenen Validierungsstudie wurde dieses Expositionssystem als übertragbares, reproduzierbares und prädiktives Screening-Verfahren zur qualitativen Bewertung der akuten lungenzytotoxizität von Partikeln in der Luft nachgewiesen. Tierversuche, die normalerweise diese toxikologische Bewertung ermöglichen würden, potenziell zu reduzieren oder zu ersetzen.
Introduction
Das Einatmen giftiger Partikel in der Luft ist ein Problem der öffentlichen Gesundheit, was zu einer Vielzahl von Gesundheitsrisiken weltweit und vielen Millionen Todesfällen jährlich1,2führt. Der Klimawandel, die fortschreitende industrielle Entwicklung und die steigende Nachfrage nach Energie,Agrar- und Konsumgütern haben in den letzten Jahren zum Anstieg der Lungenerkrankungen beigetragen3,4,5,6. Die Kenntnis und Bewertung von inhalierbaren Stoffen in Bezug auf ihre akute Inhalationstoxizität bilden die Grundlage für die Risikobewertung und das Risikomanagement, aber diese Informationen fehlen noch für eine breite Palette dieser Stoffe7,8. Seit 2006 schreibt das EU-Chemikalienrecht REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) vor, dass bereits bestehende und neu eingeführte Produkte vor dem Inverkehrbringen einer toxikologischen Charakterisierung unterzogen werden, einschließlich der Inhalationsroute. REACH konzentriert sich daher auf alternative und tierfreie Methoden, die Umsetzung des “3R”-Prinzips (Ersatz, Verfeinerung und Reduzierung von Tierversuchen) und die Verwendung geeigneter In-vitro-Modelle9. In den letzten Jahren wurden viele verschiedene und adäquate nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle (z. B. In-vitro-Zellkulturen, Lungen-auf-einen-Chip-Modelle, präzisionsgeschnittene Lungenscheiben (PCLS)) entwickelt, um die akute Inhalationstoxizität von Partikeln in der Luft5,7,10,11zu bewerten. In Bezug auf In-vitro-Zellkulturmodelle können kultivierte Zellen unter Getauchtbedingungen oder am ALI (Abbildung 1) exponiert werden. Die Gültigkeit von Unterstauchexpositionsstudien ist jedoch im Hinblick auf die Bewertung der Toxizität von Luftverbindungen, insbesondere Partikeln, begrenzt. Die Techniken der untergetauchten Exposition entsprechen nicht der menschlichen in vivo-Situation; das Zellkulturmedium, das die Zellen bedeckt, kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften und damit die toxischen Eigenschaften einer Prüfsubstanz12,13beeinflussen. ALI In-vitro-Inhalationsmodelle ermöglichen die direkte Exposition von Zellen gegenüber den Prüfsubstanzen ohne Interferenz des Zellkulturmediums mit Testpartikeln, wodurch die Exposition des Menschen mit höherer physiologischer und biologischer Ähnlichkeit als untergetauchte Expositionen12,14imitiert wird.
Für regulatorische Prozesse wie REACH stehen jedoch nur Tiermodelle im Bereich der akuten Inhalationstoxikologie zur Verfügung, da bisher keine alternativen In-vitro-Methoden ausreichend validiert und offiziell akzeptiert wurden14. Zu diesem Zweck müssen Testmodelle gemäß den Anforderungen des Referenzlabors der Europäischen Union für Alternativen zu Tierversuchen (EURL-ECVAM) zur Testgültigkeit15validiert werden.
Eine frühere Vorvalidierungsstudie und eine kürzlich abgeschlossene Validierungsstudie haben erfolgreich den Anwendungsbereich des CULTEX RFS-Expositionssystems und seine Übertragbarkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit13nachgewiesen. Dieses Expositionssystem ist ein in vitro zellbasiertes Expositionssystem, das eine homogene Exposition von Zellen gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z. B. Zigarettenrauch) am ALI aufgrund seines radialen Aerosolverteilungskonzepts und der Leitung des Testaerosols in einem kontinuierlichen Fluss über die Zellen16ermöglicht. Das Grundmodul dieses Radialdurchflusssystems besteht aus dem Einlassadapter, dem Aerosolführungsmodul mit radialer Aerosolverteilung, dem Probenahme- und Sockelmodul und einem Verriegelungsmodul mit Handrad (Abbildung 2). Die erzeugten Partikel gelangen über den Einlassadapter und das Aerosolführungsmodul in die Zellen und werden auf den Zellkultureinsätzen abgelagert, die sich in den drei radial angeordneten Belichtungskammern des Probenahmemoduls befinden. Das Aerosolführungsmodul sowie das Probenahmemodul können durch Anschluss an ein externes Wasserbad17beheizt werden.
Im Rahmen beider Studien wurden A549-Zellen für alle Expositionsexperimente eingesetzt. Die Zelllinie A549 ist eine humanverewigte Epithelzelllinie, die sehr gut charakterisiert ist und als In-vitro-Modell für Typ-II-Alveol-Epithelzellen in zahlreichen toxikologischen Studien verwendet wurde. Die Zellen zeichnen sich durch lamellenkörper, die Produktion von Tensid und eine Reihe von entzündungsrelevanten Faktoren18aus. Sie zeigen auch Eigenschaften von Bronchialepithelzellen aufgrund ihrer Schleimproduktion19. Darüber hinaus können sie im ALI kultiviert werden. Obwohl diese Zelllinie einen Mangel am Aufbau von Zell-Zell-Kontakten hat, ist die Kultivierung dieser Zellen viel bequemer, kostengünstiger und daraus abgeleitete Ergebnisse sind im Vergleich zu Primärzellen20spenderunabhängig.
A549-Zellen wurden in 6-Well-Zellkultureinsätzen (PET-Membran, 4,67 cm2, Porengröße 0,4 mm) mit einer Dichte von 3,0 x 105 Zellen pro Einsatz gesät und für 24 h unter Getauchtbedingungen kultiviert. Die Zellen wurden dann in drei unabhängigen Laboratorien der sauberen Luft und drei verschiedenen Expositionsdosen (25, 50 und 100 g/cm2) von 20 Prüfsubstanzen am ALI ausgesetzt. Die Expositionsdosis korreliert mit der Abscheidungszeit, was zu einer konstanten Partikelrate von 25 g/cm2,50 g/cm2 und 100 g/cm2 auf die Zellen nach 15, 30 bzw. 60 min führt. Die abgelagerten Partikel wurden jedoch nicht nach der Ablagerung abgewaschen, sondern blieben 24 h auf den Zellen. Die Abscheidungszeiten der Partikel betrugen somit 15, 30 und 60 min, aber die Exposition der Zellen dauerte insgesamt 24 h. Die Abscheidungsrate der Prüfsubstanzen wurde in Vorversuchen nach früheren Methoden17ermittelt.
Die Zelllebensfähigkeit als Indikator für die Toxizität wurde 24 h nach Partikelabscheidung mit einem Zelllebensfähigkeitstest bewertet. Besonderes Augenmerk wurde auf die Qualität der Reinluftsteuerungen, die Optimierung und Verfeinerung des Expositionsprotokolls, die intra- und interlaborale Reproduzierbarkeit und die Etablierung eines Vorhersagemodells (PM) gelegt. Stoffe, die zu einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit unter 50% (PM 50%) führten oder 75% (PM 75%) bei einer der drei Expositionsdosen als akute Inhalationsgefahr angesehen. Die Ergebnisse wurden dann mit bestehenden In-vivo-Daten verglichen (basierend auf mindestens einer zuverlässigen Studie nach OECD-Testleitlinie (TG) 403 oder TG 43621,22), was zu einer Gesamtübereinstimmung von 85 % mit einer Spezifität von 83 % und einer Sensitivität von 88%23führte.
Neben der Messung der Zelllebensfähigkeit können weitere Endpunkte wie Zytokinfreisetzung, Untersuchung des Zelllysats oder Membranintegrität mittels LDH-Assay bewertet werden, waren aber für die Validierungsstudie nicht erforderlich. So wurde das Expositionssystem (z.B. CULTEX RFS) als prädiktives Screening-System für die qualitative Bewertung der akuten Inhalationstoxizität der getesteten Partikel in der Luft nachgewiesen, was eine vielversprechende alternative Methode zu Tierversuchen darstellt. Das folgende Protokoll wird für Expositionsexperimente mit Partikeln in der Luft empfohlen, die dieses Expositionssystem verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle wurden in den letzten Jahren entwickelt, um Informationen über die akute Inhalationsgefahr von inhalierbaren Partikeln zu gewinnen und Tierversuche nach dem 3R-Prinzip25zu reduzieren und zu ersetzen.
In Bezug auf Zellkulturmodelle kann die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen oder am ALI erfolgen. Die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Deutschland (Zuschuss 031A581, Teilprojekt A-D)) und von der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG, Graduiertenkolleg GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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