Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida
Summary
Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall’aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all’interfaccia aria-liquido (ALI).
Abstract
Qui presentiamo un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l’esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all’ALI a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta), fornendo così un realistico l’esposizione della superficie apicale della regione alveolare umana all’aria. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare del sistema a flusso radiale soddisfa tutti i requisiti per la generazione continua e il trasporto dell’atmosfera di prova alle cellule, una distribuzione omogenea e la deposizione di le particelle e la continua rimozione dell’atmosfera. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l’esposizione delle cellule alle particelle trasportate dall’aria, ma può essere adattato all’esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione .
Nell’ambito di uno studio di convalida recentemente completato, questo sistema di esposizione si è dimostrato un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall’aria, potenzialmente riducendo o sostituendo esperimenti sugli animali che normalmente fornirebbeno questa valutazione tossicologica.
Introduction
L’inalazione di particelle atmosferiche tossiche è un problema di salute pubblica, che porta a una moltitudine di rischi per la salute in tutto il mondo e molti milioni di morti ogni anno1,2. Il cambiamento climatico, lo sviluppo industriale in corso e la crescente domanda di energia, prodotti agricoli e di consumo hanno contribuito all’aumento delle malattie polmonari negli ultimi anni3,4,5,6. La conoscenza e la valutazione delle sostanze inalabili per quanto riguarda la loro tossicità acuta per l’inalazione forniscono la base per la valutazione del rischio e la gestione del rischio, ma queste informazioni sono ancora carenti per un’ampia gamma di queste sostanze7,8. Dal 2006, la legislazione chimica dell’UE REACH (Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche) richiede che i prodotti già esistenti e di nuova introduzione siano sottoposti a una caratterizzazione tossicologica, compresa la via di inalazione prima di essere immessi sul mercato. Pertanto, REACH si concentra su metodi alternativi e privi di animali, sull’attuazione del principio “3R” (sostituzione, perfezionamento e riduzione degli esperimenti sugli animali) e sull’uso di adeguati modelli in vitro9. Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli diversi e adeguati di test di tossicità per l’inalazione non animale (ad esempio, colture in vitro cellule, modelli polmonari su un chip, fette polmonari tagliate di precisione (PCLS)) al fine di valutare la tossicità acuta dell’inalazione delle particelle trasportate dall’aria5,7,10,11. In termini di modelli di coltura cellulare in vitro, le cellule coltivate possono essere esposte in condizioni sommerse o all’ALI (Figura 1). Tuttavia, la validità degli studi sull’esposizione sommersa è limitata per quanto riguarda la valutazione della tossicità dei composti trasportati dall’aria, in particolare delle particelle. Le tecniche di esposizione sommerse non corrispondono alla situazione umana in vivo; il mezzo di coltura cellulare che copre le cellule può influenzare le proprietà fisico-chimiche e, quindi, le proprietà tossiche di una sostanza di prova12,13. I modelli di inalazione alI in vitro consentono l’esposizione diretta delle cellule alle sostanze di prova senza interferenze del mezzo di coltura cellulare con particelle di prova, imitando così l’esposizione umana con una maggiore somiglianza fisiologica e biologica rispetto alle esposizioni sommerse12,14.
Per i processi normativi come REACH, tuttavia, sono disponibili solo modelli animali nel campo della tossicologia acuta dell’inalazione, in quanto nessun metodo alternativo in vitro è stato sufficientemente convalidato e ufficialmente accettato finora14. A tale scopo, i modelli di prova devono essere convalidati in base ai requisiti del Laboratorio di riferimento dell’Unione europea per le alternative ai test sugli animali (EURL-ECVAM) sulla validità dei test15.
Un ex studio di pre-convalida e uno studio di convalida recentemente completato hanno dimostrato con successo l’area di applicazione del sistema di esposizione CULTEX RFS e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità13. Questo sistema di esposizione è un sistema di esposizione in vitro basato sulle cellule che consente l’esposizione omogenea delle cellule a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta) all’ALI a causa del suo concetto di distribuzione radiale degli aerosol e della conduzione dell’aerosol di prova in un flusso continuo sulle cellule16. Il modulo di base di questo sistema di flusso radiale è costituito dall’adattatore di ingresso, dal modulo di guida dell’aerosol con distribuzione radiale degli aerosol, dal modulo di campionamento e socket e da un modulo di bloccaggio con una ruota a mano (Figura 2). Le particelle generate raggiungono le cellule tramite l’adattatore di ingresso e il modulo di guida dell’aerosol e si depositano sugli inserti di coltura cellulare, che si trovano nelle tre camere di esposizione disposte radialmente del modulo di campionamento. Il modulo di guida dell’aerosol e il modulo di campionamento possono essere riscaldati collegandosi a un bagno d’acqua esterno17.
Nell’ambito di entrambi gli studi, le cellule A549 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti di esposizione. La linea cellulare A549 è una linea cellulare epiteliale immortalata umana che è molto ben caratterizzata ed è stata utilizzata come modello in vitro per le cellule epiteliali alveolar di tipo II in numerosi studi tossicologici. Le cellule sono caratterizzate da corpi lamellari, la produzione di surfactant e una serie di fattori rilevanti per l’infiammazione18. Mostrano anche le proprietà delle cellule epiteliali bronchiali a causa della loro produzione di muco19. Inoltre, possono essere coltivati presso l’ALI. Anche se questa linea cellulare è carente nella costruzione di contatti cellulari, la coltivazione di queste cellule è molto più conveniente, meno costose e i risultati derivati da esse sono indipendenti dal donatore rispetto alle cellule primarie20.
Le cellule A549 sono state seminate in inserti a coltura cellulare a 6 pozzetti (membrana PET, 4,67 cm2, dimensione dei pori 0,4 mm) con una densità di 3,0 x 105 celle per inserto e coltivate per 24 h in condizioni sommerse. Le cellule sono state poi esposte in tre laboratori indipendenti per pulire l’aria e tre diverse dosi di esposizione (25, 50 e 100 g/cm2) di 20 sostanze di prova all’ALI. La dose di esposizione è correlata al tempo di deposizione, con un tasso costante di particelle di 25 g/cm2,50 g/cm2 e 100 g/cm2 sulle cellule dopo 15, 30 o 60 min, rispettivamente. Le particelle depositate, tuttavia, non sono state lavate via dopo la deposizione, ma sono rimaste sulle cellule per 24 ore. I tempi di deposizione delle particelle erano quindi 15, 30 e 60 min, ma l’esposizione delle cellule è durata per 24 h in totale. Il tasso di deposizione delle sostanze di prova è stato determinato negli esperimenti preliminari secondo i metodi precedenti17.
La vitalità cellulare come indicatore di tossicità è stata valutata 24 h dopo la deposizione di particelle utilizzando un saggio di fattibilità cellulare. Particolare attenzione è stata posta sulla qualità dei controlli dell’aria pulita, sull’ottimizzazione e perfezionamento del protocollo di esposizione, sulla riproducibilità intra e interlaboratorio e sulla creazione di un modello di previsione (PM). Sostanze che hanno portato a una diminuzione della vitalità cellulare al di sotto del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) in una delle tre dosi di esposizione è stato considerato un rischio di inalazione acuta. I risultati sono stati poi confrontati con i dati in vivo esistenti (sulla base di almeno uno studio affidabile secondo le linee guida dei test dell’OCSE (TG) 403 o TG 43621,22), che porta ad una concordanza complessiva dell’85%, con una specificità dell’83% e una sensibilità dell’88%23.
Oltre alla misurazione della vitalità cellulare, altri endpoint come il rilascio di citochine, l’esame dell’integrità del lisato cellulare o della membrana tramite l’analisi LDH possono essere valutati, ma non sono stati richiesti per lo studio di convalida. Pertanto, il sistema di esposizione (ad esempio, CULTEX RFS) si è dimostrato un sistema di screening predittivo per la valutazione qualitativa della tossicità acuta dell’inalazione delle particelle airotrasportate testate, rappresentando un promettente metodo alternativo alla sperimentazione animale. Il seguente protocollo è raccomandato per gli esperimenti di esposizione alle particelle trasportate dall’aria utilizzando questo sistema di esposizione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli di test di tossicità per l’inalazione non animale al fine di ottenere informazioni sul rischio di inalazione acuta delle particelle inalabili e per ridurre e sostituire gli esperimenti sugli animali secondo il principio 3R25.
In termini di modelli di coltura cellulare, l’esposizione delle cellule può essere effettuata in condizioni sommerse o all’ALI. Esporre le cellule in condizioni sommerse può influenzare le pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell’Istruzione e della Ricerca (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Germania (Grant 031A581, sub-progetto A-D)) e dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Ricerca Training Group GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
Riferimenti
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