كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.
Abstract
المناعة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لاستكشاف التعبير عن البروتين وتوطينه خلال كل من حالات النمو والأمراض الطبيعية. على الرغم من أن العديد من بروتوكولات الكيمياء المناعية قد تم تحسينها لأنسجة الثدييات وأقسام الأنسجة ، فإن هذه البروتوكولات غالبًا ما تتطلب التعديل والتحسين للكائنات النموذجية غير الثديية. تستخدم سمكة الحمار الوحشي بشكل متزايد كنظام نموذجي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية والانتقالية للتحقيق في الآليات الجزيئية والوراثية والبيولوجية للخلايا في عمليات التطوير. حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنظام نموذجي ولكن أيضا تتطلب تقنيات معدلة للكشف عن البروتين الأمثل. هنا ، نقدم بروتوكولنا لكامل جبل الفلورالكيمياء المناعية في أجنة حمار وحشي واليرقات. ويصف هذا البروتوكول بالإضافة إلى ذلك عدة استراتيجيات مختلفة للتركيب يمكن استخدامها ونظرة عامة على المزايا والعيوب التي توفرها كل استراتيجية. كما نصف أيضًا التعديلات المدخلة على هذا البروتوكول للسماح بالكشف عن ركائز الكروموجين في أنسجة اليتصاعد الكاملة والكشف عن الفلورسينس في أنسجة اليرقات المقطعة. ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على دراسة العديد من مراحل النمو والهياكل الجنينية.
Introduction
ظهر سمك الحمار الوحشي(Danio rerio)كنموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية لعدة أسباب بما في ذلك وقت الجيل القصير ، والتطور السريع ، وسهولة التقنيات الوراثية. ونتيجة لذلك، تستخدم عادة حمار وحشي في المستويات العالية من الإنتاجية الصغيرة الجزيئات شاشات للبحوث السمية واكتشاف المخدرات. كما أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج جذاب لدراسة عمليات النمو بالنظر إلى أن أنثى واحدة يمكنها إنتاج 50-300 بيضة بشكل روتيني في كل مرة، وأن الأجنة الواضحة بصريًا تتطور خارجيًا مما يسمح بالتصور الفعال لعمليات النمو. ومع ذلك، اعتمدت الأبحاث المبكرة في الغالب على الشاشات الوراثية الأمامية باستخدام N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) أو غيرها من المغيرات بسبب التحديات في إنشاء تقنيات وراثية عكسية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمان ، تم استخدام موربولينو لأول مرة في حمار وحشي لضرب الجينات المستهدفة1. مورفولينوس هي قلة القلة المضادة للشعور الصغيرة التي تمنع ترجمة مرنا المستهدفة بعد الحقن المجهري في الجنين في مرحلة مبكرة من النمو. نقطة ضعف رئيسية من موربولينوس هو أنها مخففة كما تنقسم الخلايا وتفقد فعاليتها عموما من قبل 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf). في حين أن morpholinos لا تزال أداة قوية لتعطيل الجينات حمار وحشي، النسخ المنشط مثل تأثير nucleases (TALENs)، nucleases الزنك الإصبع (ZFNs)، ومتجمعة بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPRs) يتم استخدامها في الآونة الأخيرة لاستهداف الجينوم حمار وحشي مباشرة2،3. وقد أنشأت هذه الاستراتيجيات الجينية العكسية، إلى جانب علم الوراثة إلى الأمام وشاشات الإنتاجية العالية، سمك الحمار الوحشي كنموذج قوي لدراسة التعبير الجيني والوظيفة.
تتطلب القدرة على دراسة وظيفة الجينات بشكل عام تقييمًا للتوزيع المكاني والزمني للتعبير عن الجينات أو المنتجات الجينية. الأسلوبان الأكثر استخداماً لتصور أنماط التعبير هذه أثناء التطوير المبكر هما التهجين في الموقع (ISH) وكيمياء الهيستوكيميائية الكاملة (IHC). في الموقع تم تطوير التهجين لأول مرة في عام 1969 ويعتمد على استخدام مسابير الحمض النووي الريبي المضادة للتحسس للكشف عن تعبير مرنا في كائن حي4. في المقابل، يتم استخدام الأجسام المضادة المسماة في الكيمياء المناعية لتصور التعبير البروتيني. تعود فكرة وضع العلامات على البروتينات للكشف عنها إلىعام 1930 و5 وتم نشر أول تجربة للسنة الدولية للخدمات الإنسانية في عام 1941 عندما تم استخدام الأجسام المضادة المسماة FITC للكشف عن البكتيريا المسببة للأمراض في الأنسجة المصابة6. وقد تطورت ISH وIHC بشكل ملحوظ على مدى العقود اللاحقة ، وتستخدم الآن على حد سواء بشكل روتيني في مختبر البحوث الجزيئية والتشخيصية7،8،9،10،11. في حين أن كلا التقنيتين لها مزايا وعيوب ، تقدم المدينة العالمية للخدمات الإنسانية العديد من الفوائد على ISH. عمليا ، هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة من ISH وعموما أقل تكلفة اعتمادا على تكلفة الأجسام المضادة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، التعبير مرنا ليست دائما مقياس موثوق به من التعبير البروتين كما ثبت في الفئران والبشر أن حوالي ثلث فقط من البروتين وفرة الاختلاف يمكن تفسيره من قبل وفرة مرنا12. لهذا السبب، تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مكملاً هاماً لتأكيد بيانات ISH، عندما يكون ذلك ممكناً. وأخيراً، يمكن أن توفر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بيانات دون خلوية وبيانات توطين مشترك لا يمكن تحديدها بواسطة ISH13و14و15. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة للكشف الموثوق عن البروتينات عن طريق الكيمياء المناعية في أجنة ويرقات حمار وحشي جبل كامل. الهدف من هذه التقنية هو تحديد التعبير المكاني والزماني لبروتين مهم في الجنين بأكمله. تستخدم هذه التقنية الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضدات والأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلور. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام على أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح وللاستخدام مع ركائز كروموجينية بدلاً من الفلورسينس. باستخدام هذا البروتوكول, ونحن نثبت أن تطوير حمار وحشي العضلات الهيكل العظمي يعبر عن مستقبلات الغلوتامات ionotropic, بالإضافة إلى مستقبلات أستيل. NMDA من نوع الغلوتامات مستقبلات الوحدات الفرعية يمكن الكشف عنها على العضلات الطولية في 23 hpf.
Protocol
Representative Results
Discussion
المناعة هي أداة متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها لتوصيف التعبير المكاني والزماني من أي بروتين تقريبا من الفائدة في كائن حي. يستخدم الكيمياء المناعية على مجموعة واسعة من الأنسجة والكائنات الحية النموذجية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام في حمار وحشي. قد تتطلب الكيمياء المناع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل من المعاهد القومية للصحة منحة 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Riferimenti
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscienze. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
