Hele Mount Immunhistokemi i Zebrafish Embryoner og Larver
Summary
Her præsenterer vi en protokol for fluorescerende antistofmedieret påvisning af proteiner i hele præparater af zebrafiskembryoner og larver.
Abstract
Immunhistokemi er en udbredt teknik til at udforske protein udtryk og lokalisering under både normal udviklingsmæssige og sygdomstilstande. Selv om mange immunhistokemi protokoller er blevet optimeret til pattedyr væv og væv sektioner, disse protokoller kræver ofte ændring og optimering for ikke-pattedyr model organismer. Zebrafisk bruges i stigende grad som et modelsystem inden for grundlæggende, biomedicinsk og translationel forskning for at undersøge de molekylære, genetiske og cellebiologiske mekanismer i udviklingsprocesser. Zebrafisk tilbyder mange fordele som modelsystem, men kræver også modificerede teknikker for optimal proteindetektion. Her leverer vi vores protokol for hel-mount fluorescens immunhistokemi i zebrafisk embryoner og larver. Denne protokol beskriver desuden flere forskellige monteringsstrategier, der kan anvendes, og en oversigt over de fordele og ulemper, som hver strategi giver. Vi beskriver også ændringer af denne protokol for at gøre det muligt at påvise kromogene substrater i hele mount væv og fluorescens detektion i opdelt larvevæv. Denne protokol finder stort set anvendelse på studiet af mange udviklingsstadier og embryonale strukturer.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) har vist sig som en stærk model for studiet af biologiske processer af flere årsager, herunder kort produktionstid, hurtig udvikling og faciliteter over for genetiske teknikker. Som et resultat, zebrafisk er almindeligt anvendt i høj gennemløb små molekyle skærme til toksikologisk forskning og narkotika opdagelse. Zebrafisk er også en attraktiv model for studiet af udviklingsprocesser, da en enkelt kvinde rutinemæssigt kan producere 50-300 æg ad gangen, og de optisk klare embryoner udvikler sig eksternt, hvilket giver mulighed for effektiv visualisering af udviklingsprocesser. Men tidlig forskning var mest baseret på fremadrettede genetiske skærme ved hjælp af N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagener på grund af udfordringer i etableringen af omvendt genetiske teknikker. Omkring to årtier siden, morpholinos blev første gang brugt i zebrafisk til knockdown målrettede gener1. Morpholinos er små antisense oligonucleotider, der hæmmer oversættelsen af mål mRNA efter mikroinjektion til et foster på et tidligt udviklingsstadie. En stor svaghed ved morfoinos er, at de er fortyndet som cellerne kløft og generelt mister effektivitet med 72 timer efter-befrugtning (hpf). Mens morfoinos fortsat er et kraftfuldt værktøj til zebrafisk genforstyrrelser, transskription aktivator-lignende effector nucleases (TALENs), zink-finger nucleases (ZFNs), og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromic gentagelser (CRISPRs) er for nylig bruges til direkte at målrette zebrafisk genom2,3. Disse omvendte genetiske strategier, i kombination med fremgenetik og høj gennemløb skærme, har etableret zebrafisk som en kraftfuld model til at studere genekspression og funktion.
Evnen til at studere genfunktion kræver generelt en evaluering af den spatio-tidsmæssige fordeling af gen- eller genproduktekspression. De to mest almindeligt anvendte teknikker til at visualisere sådanne udtryksmønstre under tidlig udvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunhistokemi (IHC). In situ hybridisering blev først udviklet i 1969 og er afhængig af brugen af mærket antisense RNA sonder til at detektere mRNA udtryk i en organisme4. I modsætning hertil anvendes mærkede antistoffer i immunhistokemi til at visualisere proteinekspression. Ideen om mærkning af proteiner til påvisning går tilbage til 1930’erne5 og det første IHC-eksperiment blev offentliggjort i 1941, da FITC-mærkede antistoffer blev brugt til at detektere patogene bakterier i inficeret væv6. ISH og IHC har udviklet sig og forbedret betydeligt i de efterfølgende årtier og anvendes nu begge rutinemæssigt i det molekylære og diagnostiske forskningslaboratorium7,8,9,10,11. Mens begge teknikker har fordele og ulemper, IHC tilbyder flere fordele i forhold til ISH. Praktisk, IHC er langt mindre tidskrævende end ISH og er generelt billigere afhængigt af omkostningerne ved den primære antistof. Desuden er mRNA-udtryk ikke altid en pålidelig metrisk proteinekspression, da det er blevet påvist hos mus og mennesker, at kun omkring en tredjedel af proteintæthedsvariationen kan forklares ved mRNA-tæthed12. Af denne grund, IHC er et vigtigt supplement til at bekræfte ISH data, når det er muligt. Endelig kan IHC levere subcellulære og co-lokaliseringsdata , der ikke kan bestemmes af ISH13,14,15. Her beskriver vi en trinvis metode til pålideligt at opdage proteiner ved immunhistokemi i hele mount zebrafisk embryoner og larver. Formålet med denne teknik er at bestemme det rumlige og tidsmæssige udtryk for et protein af interesse for hele fosteret. Denne teknologi anvender antigenspecifikke primære antistoffer og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. Protokollen kan let tilpasses til brug på glidemonterede vævssektioner og til brug med kromoogenesubstrater i stedet for fluorescens. Ved hjælp af denne protokol, Vi viser, at udvikle zebrafisk skeletmuskulatur udtrykker ionotropic glutamat receptorer, ud over acetylcholin receptorer. NMDA-type glutamat receptor underenheder kan påvises på langsgående muskel på 23 hpf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunhistokemi er et alsidigt værktøj, der kan bruges til at karakterisere spatio-tidsmæssige udtryk for stort set ethvert protein af interesse i en organisme. Immunhistokemi anvendes på en bred vifte af væv og model organismer. Denne protokol er optimeret til brug i zebrafisk. Immunhistokemi hos forskellige arter kan kræve forskellige fikserings- og håndteringsteknikker, blokeringsopløsninger afhængigt af arter og tilstedeværelsen af endogenperoxidaser og inkubationstider på grund af vævs tykkelse og sammens…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra NIH tilskud 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Riferimenti
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscienze. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
