Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.
Abstract
La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para explorar la expresión y localización de proteínas durante los estados normales de desarrollo y enfermedad. Aunque muchos protocolos de inmunohistoquímica se han optimizado para secciones de tejido y tejido de mamíferos, estos protocolos a menudo requieren modificación y optimización para organismos modelo no mamíferos. El pez cebra se utiliza cada vez más como sistema modelo en la investigación básica, biomédica y traslacional para investigar los mecanismos biológicos moleculares, genéticos y celulares de los procesos de desarrollo. Zebrafish ofrece muchas ventajas como sistema modelo, pero también requieren técnicas modificadas para una detección óptima de proteínas. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para la inmunohistoquímica de fluorescencia de montaje completo en embriones y larvas de peces cebra. Este protocolo también describe varias estrategias de montaje diferentes que se pueden emplear y una visión general de las ventajas y desventajas que proporciona cada estrategia. También describimos modificaciones a este protocolo para permitir la detección de sustratos cromogénicos en el tejido de montaje completo y la detección de fluorescencia en el tejido larvario seccionado. Este protocolo es ampliamente aplicable al estudio de muchas etapas de desarrollo y estructuras embrionarias.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo poderoso para el estudio de los procesos biológicos por varias razones, incluyendo el corto tiempo de generación, el desarrollo rápido, y la amenabilidad a las técnicas genéticas. Como resultado, el pez cebra se utiliza comúnmente en pantallas de moléculas pequeñas de alto rendimiento para la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos. El pez cebra también es un modelo atractivo para el estudio de los procesos de desarrollo, ya que una sola hembra puede producir rutinariamente 50-300 huevos a la vez y los embriones ópticamente claros se desarrollan externamente permitiendo una visualización eficiente de los procesos de desarrollo. Sin embargo, las primeras investigaciones se basaron principalmente en pantallas genéticas delanteras utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) u otros mutágenos debido a los desafíos en el establecimiento de técnicas genéticas inversas. Hace aproximadamente dos décadas, los morfosolinos se utilizaron por primera vez en peces cebra para derribar genes dirigidos1. Los morpholinos son pequeños oligonucleótidos antisentido que inhiben la traducción del ARNm objetivo después de la microinyección en un embrión en una etapa temprana del desarrollo. Una debilidad importante de los morfolinos es que se diluyen a medida que las células se dividen y generalmente pierden eficacia en 72 horas después de la fertilización (hpf). Si bien los morfolinos siguen siendo una poderosa herramienta para la alteración del gen del pez cebra, las nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALEN), las nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) interespaciadas regularmente agrupadas se utilizan más recientemente para apuntar directamente al genoma del pez cebra2,3. Estas estrategias genéticas inversas, en combinación con la genética delantera y las pantallas de alto rendimiento, han establecido el pez cebra como un modelo poderoso para estudiar la expresión y la función génicas.
La capacidad de estudiar la función génica generalmente requiere una evaluación de la distribución espacio-temporal de la expresión de genes o genes. Las dos técnicas más utilizadas para visualizar estos patrones de expresión durante el desarrollo temprano son la hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC). La hibridación in situ se desarrolló por primera vez en 1969 y se basa en el uso de sondas de ARN antisentido etiquetadas para detectar la expresión de ARNm en un organismo4. Por el contrario, los anticuerpos etiquetados se utilizan en la inmunohistoquímica para visualizar la expresión de proteínas. La idea de etiquetar proteínas para la detección se remonta a los5 de 1930 y el primer experimento del IHC se publicó en 1941 cuando se utilizaron anticuerpos etiquetados con FITC para detectar bacterias patógenas en los tejidos infectados6. ISH e IHC han evolucionado y mejorado significativamente en las décadas siguientes y ahora se utilizan rutinariamente en el laboratorio de investigación molecular y diagnóstica7,8,9,10,11. Si bien ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, IHC ofrece varios beneficios sobre ISH. Prácticamente, IHC consume mucho menos tiempo que la ISH y generalmente es menos costoso dependiendo del costo del anticuerpo primario. Además, la expresión de ARNm no siempre es una métrica fiable de la expresión de proteínas, ya que se ha demostrado en ratones y humanos que sólo alrededor de un tercio de la variación de la abundancia de proteínas puede explicarse por la abundancia de ARNm12. Por esta razón, IHC es un suplemento importante para confirmar los datos de ISH, cuando sea posible. Por último, IHC puede proporcionar datos subcelulares y de colocalización que no pueden ser determinados por ISH13,14,15. Aquí, describimos un método paso a paso para detectar de forma fiable las proteínas mediante inmunohistoquímica en embriones y larvas de pez cebra de montaje completo. El objetivo de esta técnica es determinar la expresión espacial y temporal de una proteína de interés en todo el embrión. Esta tecnología utiliza anticuerpos primarios específicos para antígenos y anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente. El protocolo es fácilmente adaptable para su uso en secciones de tejido deslizante y para su uso con sustratos cromogénicos en lugar de fluorescencia. Usando este protocolo, demostramos que el desarrollo de músculo esquelético de pez cebra expresa receptores de glutamato ionotrópico, además de receptores de acetilcolina. Las subunidades del receptor de glutamato de tipo NMDA son detectables en el músculo longitudinal a 23 hpf.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inmunohistoquímica es una herramienta versátil que se puede utilizar para caracterizar la expresión espacio-temporal de prácticamente cualquier proteína de interés en un organismo. La inmunohistoquímica se utiliza en una amplia variedad de tejidos y organismos modelo. Este protocolo ha sido optimizado para su uso en peces cebra. La inmunohistoquímica en diferentes especies puede requerir diferentes técnicas de fijación y manipulación, bloqueando las soluciones dependiendo de las especies y la presencia de p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación de NIH subvención 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Riferimenti
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