Hela mount immunohistokemi i zebrafisk embryon och larver
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för fluorescerande antikroppsmedierad detektion av proteiner i hela preparat av zebrafiskembryon och larver.
Abstract
Immunohistokemi är en allmänt använd teknik för att utforska proteinuttryck och lokalisering under både normala utvecklings- och sjukdomstillstånd. Även om många immunohistokemi protokoll har optimerats för däggdjur vävnad och vävnad sektioner, dessa protokoll kräver ofta modifiering och optimering för icke-däggdjur modell organismer. Zebrafiskar används i allt högre grad som ett modellsystem inom grundläggande, biomedicinsk och translationell forskning för att undersöka de molekylära, genetiska och cellbiologiska mekanismerna i utvecklingsprocesser. Zebrafisk erbjuder många fördelar som modellsystem men kräver också modifierade tekniker för optimal proteindetektering. Här tillhandahåller vi vårt protokoll för helmount fluorescensimmunohistokemi i zebrafiskembryon och larver. Detta protokoll beskriver dessutom flera olika monteringsstrategier som kan användas och en översikt över de fördelar och nackdelar som varje strategi ger. Vi beskriver också ändringar av detta protokoll för att möjliggöra detektion av kromogena substrat i hela montera vävnad och fluorescens detektion i sektionerad larvvävnad. Detta protokoll är i stort sett tillämpligt på studier av många utvecklingsstadier och embryonala strukturer.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) har vuxit fram som en kraftfull modell för studier av biologiska processer av flera skäl, inklusive kort generationstid, snabb utveckling och amenability till genetiska tekniker. Som ett resultat, zebrafisk används ofta i hög genomströmning små molekylskärmar för toxikologisk forskning och läkemedelsupptäckt. Zebrafisk är också en attraktiv modell för studier av utvecklingsprocesser med tanke på att en enda hona rutinmässigt kan producera 50-300 ägg åt gången och de optiskt klara embryonutvecklas externt möjliggör effektiv visualisering av utvecklingsprocesser. Tidig forskning förlitade sig dock främst på framåt genetiska skärmar med N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller andra mutagena ämnen på grund av utmaningar i upprättandet av omvänd genetisk teknik. Ungefär två decennier sedan användes morfononer först i zebrafisk för att knockdown riktade gener1. Moroler är små antisense oligonucleotides som hämmar översättning av mål mRNA efter microinjection till ett embryo i ett tidigt utvecklingsstadium. En stor svaghet i morfonos är att de späds ut som cellerna delar och i allmänhet förlorar effektivitet med 72 timmar efter befruktning (HPF). Medan morfonos fortfarande ett kraftfullt verktyg för zebrafisk genstörningar, transkription aktivator-liknande effektor nucleases (TALENs), zink-finger nucleases (ZFNs), och klustrade regelbundet interspaced kort palindromic upprepar (CRISPRs) är mer nyligen används för att direkt rikta zebrafiskgenomet 2,3. Dessa omvända genetiska strategier, i kombination med framåt genetik och hög genomströmning skärmar, har etablerat zebrafisk som en kraftfull modell för att studera genuttryck och funktion.
Förmågan att studera genfunktion kräver i allmänhet en utvärdering av spatio-temporal fördelning av gen- eller genproduktuttryck. De två vanligaste teknikerna för att visualisera sådana uttrycksmönster under tidig utveckling är in situ hybridisering (ISH) och hela montera immunohistokemi (IHC). In situ hybridisering utvecklades först 1969 och bygger på användning av märkta antisense RNA sonder för att upptäcka mRNA uttryck i en organism4. Däremot används märkta antikroppar i immunohistokemi för att visualisera proteinuttryck. Idén att märka proteiner för detektion går tillbaka till 1930-talet5 och det första IHC-experimentet publicerades 1941 när FITC-märkta antikroppar användes för att upptäcka patogena bakterier i infekterade vävnader6. ISH och IHC har utvecklats och förbättrats avsevärt under de följande decennierna och används nu båda rutinmässigt i det molekylära och diagnostiska forskningslaboratoriet7,8,9,10,11. Medan båda teknikerna har fördelar och nackdelar, erbjuder IHC flera fördelar jämfört med ISH. Praktiskt taget är IHC mycket mindre tidskrävande än ISH och är i allmänhet billigare beroende på kostnaden för den primära antikroppen. Dessutom är mRNA uttryck inte alltid ett tillförlitligt mått på proteinuttryck som det har visats hos möss och människor att endast ungefär en tredjedel av protein överflöd variation kan förklaras av mRNA överflöd12. Av denna anledning, IHC är ett viktigt komplement för att bekräfta ISH data, när det är möjligt. Slutligen kan IHC tillhandahålla subcellulära och samlokaliseringsdata som inte kan bestämmas av ISH13,14,15. Här beskriver vi en steg-för-steg-metod för att på ett tillförlitligt sätt upptäcka proteiner genom immunohistokemi i hela berget zebrafiskembryon och larver. Målet med denna teknik är att bestämma den rumsliga och tidsmässiga uttryck för ett protein av intresse för hela embryot. Denna teknik använder antigen-specifika primära antikroppar och fluorescerande taggade sekundära antikroppar. Protokollet är lätt anpassningsbart att använda på glidmonterade vävnadssektioner och för användning med kromogena substrat i stället för fluorescens. Med hjälp av detta protokoll visar vi att utveckla zebrafisk skelettmuskulatur uttrycker jonotropa glutamatreceptorer, förutom acetylkolinreceptorer. NMDA-typ glutamatreceptor underenheter kan upptäckas på längsgående muskel vid 23 hpf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunohistokemi är ett mångsidigt verktyg som kan användas för att karakterisera spatio-temporaluttryck av praktiskt taget alla protein av intresse för en organism. Immunohistokemi används på en mängd olika vävnader och modellorganismer. Detta protokoll har optimerats för användning i zebrafisk. Immunohistokemi hos olika arter kan kräva olika fixering och hanteringstekniker, blockera lösningar beroende på arter och förekomsten av endogena peroxidaser och inkubationstider på grund av vävnadernas tjocklek …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering från NIH-bidrag 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Riferimenti
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscienze. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
