Optimización de procesos mediante microbiorreactores automatizados de alto rendimiento en el cultivo de células de ovario de hámster chino
Summary
Aquí, presentamos un procedimiento detallado para ejecutar un Diseño de Experimento en un microbiorreactor automatizado seguido de cosecha celular y cuantificación de proteínas usando una columna de Proteína A.
Abstract
La optimización de los bioprocesos para aumentar el rendimiento de los productos deseados es importante en la industria biofarmacéutica. Esto se puede lograr mediante la selección de deformaciones unitarias y mediante el desarrollo de parámetros de bioproceso. Los matraces de agitación se han utilizado para este propósito. Sin embargo, carecen de la capacidad de controlar los parámetros del proceso, como el pH y el oxígeno disuelto (DO). Esta limitación se puede superar con la ayuda de un microbiorreactor automatizado. Estos biorreactores imitan el cultivo a mayor escala. Una de las principales ventajas de este sistema es la integración del Diseño de Experimento (DOE) en el software. Esta integración permite establecer un diseño en el que se pueden variar simultáneamente varios parámetros de proceso. Los parámetros críticos del proceso y las condiciones óptimas del bioproceso se pueden analizar dentro del software. El objetivo del trabajo presentado aquí es introducir al usuario en los pasos involucrados en el diseño de procesos en el software y la incorporación del DOE dentro de la ejecución de cultivo.
Introduction
El mercado biofarmacéutico mundial valía más de 250.000 millones de dólares EE.UU. en 2018 y ha ido en continua expansión1. Las compañías farmacéuticas están pasando de producir pequeños fármacos moleculares a terapias producidas biotecnológicamente, como proteínas recombinantes. Estos son los únicos responsables de un ingreso de más de $150 mil millones1. Las células de mamíferos ahora se utilizan ampliamente para la producción de estas proteínas recombinantes farmacéuticas. En el período actual, entre los 68 productos aprobados producidos por células de mamíferos, 57 son producidos por células de ovario de hámster chino (CHO)2. Las células CHO se utilizan específicamente para la producción de proteínas recombinantes que requieren modificaciones post-traduccionales. Estas células son preferidas ya que crecen en una suspensión y, por lo tanto, permiten resultados reproducibles en un medio libre de suero definido químicamente3,,4. La otra ventaja de utilizar células CHO es que la estructura glicana del producto se asemeja a la del anticuerpo monoclonal humano (mAb) y da como resultado un mayor rendimiento proteico recombinante y una productividad específica debido a la amplificación del gen5.
El rendimiento del cultivo celular CHO recombinante (rCHO) se ha multiplicado por cien en las últimas dos décadas. Esta mejora se atribuye a la optimización de los parámetros del proceso, la estrategia de alimentación y el desarrollo del medio libre de suero definido químicamente6. Con el aumento de los requisitos de los productos farmacéuticos, la presión aumenta en el costo y la eficiencia del tiempo para el desarrollo del proceso de producción7. Para reducir la presión y garantizar la calidad del producto, se ha orientado el enfoque de la industria farmacéutica en la calidad por diseño (QbD). QbD se utiliza para comprender la producción del producto, así como el proceso. Una herramienta vital utilizada en el ObD es el Diseño del Experimento (DOE). Ayuda a aumentar la comprensión del proceso al revelar la relación entre varias variables de entrada y los datos de salida resultantes. La aplicación del enfoque DOE para optimizar el bioproceso es beneficiosa durante las primeras etapas del proyecto al asimilar las condiciones del proceso y aumentar la cantidad y calidad del título. Este enfoque es beneficioso en comparación con la estrategia anticuada: un factor a la vez (OFAT). Los enfoques estadísticos del DOE utilizando Classical, Shainin o Taguchi son muy superiores a los OFAT8.
El proceso y la optimización de medios se pueden realizar en matraces de agitación. Los matraces son relativamente baratos. Sin embargo, no es posible controlar parámetros como la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto (DO). Para superar estos inconvenientes, se pueden utilizar biorreactores multiusos de sobremesa que van desde un volumen de trabajo de 0,5 L a 5 L. Los reactores proporcionan una amplia supervisión en línea y control de procesos. Sin embargo, el uso del biorreactor multiusos es intensivo en tiempo y mano de obra. Para superar estas desventajas, se utiliza un novedoso biorreactor de un solo uso que combina el proceso integral de monitorización del biorreactor de sobremesa y fácil manejo del matraz de agitación. El sistema de cribado de alto rendimiento y la tecnología de un solo uso han contribuido a mejorar la eficiencia del rendimiento y desarrollo de los procesos9.
En este artículo, se enumeran las pautas para cargar la receta en el software automatizado de microbiorreactor (AMBR). Durante el transcurso de este experimento se estudia la influencia de diferentes velocidades de agitador y pH en la concentración celular viable (VCC) y el titador. El resultado experimental y el análisis se llevan a cabo con el diseño del software de experimento MODDE 12. Los análisis de productos se llevan a cabo en un sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con una columna de proteína A. Se basa en el principio de que la región Fc del mAb se une a la proteína A con alta afinidad10,,11. Con este método, es posible identificar y cuantificar el mAb. La cuantificación se lleva a cabo en las áreas de pico de elución medida a 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
La optimización del proceso para aumentar el rendimiento es de vital importancia en la industria biofarmacéutica. Los matraces de agitación podrían utilizarse potencialmente para el cribado de la cepa; sin embargo, la supervisión de los parámetros del proceso como pH y DO no están disponibles en los matraces. Los microbiorreactores tienen una ventaja, ya que permiten un seguimiento y control continuos del proceso. Estos bucles de control en el microbiorreactor también proporcionan una condición similar a las de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren dar las gracias al Bundesministerium f’r Bildung und Forschung (BMBF), al Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, y al equipo de Bioprocesamiento de Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania, por su apoyo.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
Riferimenti
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