Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerde procedure om een ontwerp van experiment uit te voeren in een geautomatiseerde micro-bioreactor gevolgd door celoogst en eiwitkwantificering met behulp van een Protein A-kolom.
Abstract
Optimalisatie van bioprocessen om de opbrengst van gewenste producten te verhogen is van belang in de biofarmaceutische industrie. Dit kan worden bereikt door stamselectie en door bioprocesparameters te ontwikkelen. Hiervoor zijn schudkolven gebruikt. Ze missen echter de mogelijkheid om de procesparameters zoals pH en opgeloste zuurstof (DO) te controleren. Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van een geautomatiseerde micro-bioreactor. Deze bioreactoren bootsen de teelt op grotere schaal na. Een van de grote voordelen van dit systeem is de integratie van het Design of Experiment (DOE) in de software. Deze integratie maakt het mogelijk om een ontwerp te maken waarbij meerdere procesparameters tegelijkertijd kunnen worden gevarieerd. De kritische procesparameters en optimale bioprocesomstandigheden kunnen binnen de software worden geanalyseerd. De focus van het werk hier gepresenteerd is om de gebruiker kennis te laten maken met de stappen die betrokken zijn bij procesontwerp in de software en integratie van de DOE binnen de teelt run.
Introduction
De wereldwijde biofarmaceutische markt was in 2018 meer dan US $250 miljard waard en is voortdurend gegroeid1. Farmaceutische bedrijven gaan af van de productie van kleine moleculaire geneesmiddelen naar biotechnologisch geproduceerde therapieën zoals recombinante eiwitten. Deze alleen al zijn verantwoordelijk voor een omzet van meer dan $ 150 miljard1. Zoogdiercellen worden nu op grote schaal gebruikt voor de productie van deze farmaceutische recombinante eiwitten. In de huidige periode worden onder de 68 goedgekeurde producten die door zoogdiercellen worden geproduceerd, 57 geproduceerd door Chinese hamstereierstokcellen (CHO)2. CHO cellen worden specifiek gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten die post-translationele wijzigingen vereisen. Deze cellen hebben de voorkeur omdat ze in een suspensie groeien en daardoor reproduceerbare resultaten mogelijk maken in een serumvrij chemisch gedefinieerd medium3,4. Het andere voordeel van het gebruik van CHO-cellen is dat de glycanstructuur van het product lijkt op die van het menselijke monoklonale antilichaam (mAb) en resulteert in een hogere recombinante eiwitopbrengst en specifieke productiviteit als gevolg van genversterking5.
De opbrengst van recombinant CHO (rCHO) celcultuur is de afgelopen twee decennia met honderd keer toegenomen. Deze verbetering wordt toegeschreven aan de optimalisatie van de procesparameters, voedingsstrategie en ontwikkeling van serumvrij chemisch gedefinieerd medium6. Met de toename van de eisen van de farmaceutische producten neemt de druk toe op kosten- en tijdefficiëntie voor de ontwikkeling van het productieproces7. Om de druk te verminderen en tegelijkertijd de productkwaliteit te waarborgen, heeft de focus van de farmaceutische industrie op Quality by Design (QbD) verschoven. QbD wordt gebruikt om de productproductie en het proces te begrijpen. Een essentieel hulpmiddel dat in obd wordt gebruikt is het Ontwerp van Experiment (DOE). Het helpt het begrip van het proces te vergroten door de relatie tussen verschillende invoervariabelen en resulterende uitvoergegevens te onthullen. Het toepassen van de DOE-aanpak om het bioproces te optimaliseren is nuttig in de vroege stadia van het project bij het assimileren van de procesomstandigheden en het verhogen van de titer kwantiteit en kwaliteit. Deze aanpak is gunstig in vergelijking met de ouderwetse strategie: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistische benaderingen van DOE met behulp van Klassieke, Shainin of Taguchi zijn veel beter dan de OFAT8.
Het proces en de media optimalisatie kan worden uitgevoerd in shake kolven. De kolven zijn relatief goedkoop. Het is echter niet mogelijk om parameters zoals temperatuur, pH en opgeloste zuurstof (DO) te regelen. Om deze nadelen te overwinnen, kunnen multifunctionele bench-top bioreactoren, variërend van werkvolume van 0,5 L tot 5 L, worden gebruikt. De reactoren zorgen voor een uitgebreide on-line monitoring en procescontrole. Het gebruik van de multifunctionele bioreactor is echter tijd- en arbeidsintensief. Om deze nadelen te overwinnen, wordt een nieuwe bioreactor voor eenmalig gebruik gebruikt die het uitgebreide proces van het monitoren van de bench-top bioreactor en het eenvoudig hanteren van de schudkolf combineert. Het screeningsysteem met een hoge doorvoer en de technologie voor eenmalig gebruik hebben bijgedragen tot een verbetering van de efficiëntie van procesprestaties en -ontwikkeling9.
In dit artikel worden de richtlijnen voor het laden van het recept in de geautomatiseerde microbioreactor (AMBR) software vermeld. De invloed van verschillende roerdersnelheden en pH op de levensvatbare celconcentratie (VCC) en titer wordt in de loop van dit experiment bestudeerd. Het experimentele resultaat en de analyse worden uitgevoerd met ontwerp van experimentsoftware MODDE 12. De productanalyses worden uitgevoerd in een hplc-systeem (hoge druk vloeistofchromatografie) met een Protein A-kolom. Het is gebaseerd op het principe dat het Fc-gebied van de mAb bindt aan eiwit A met hoge affiniteit10,11. Met deze methode is het mogelijk om de mAb te identificeren en te kwantificeren. De kwantificering vindt plaats boven de gemeten elutiepiekgebieden met 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimalisatie van het proces om de opbrengst te verhogen is van cruciaal belang in de biofarmaceutische industrie. Schudkolven kunnen mogelijk worden gebruikt voor het screenen van de stam; De bewaking van de procesparameters zoals pH en DO zijn echter niet beschikbaar in de kolven. De microbioreactoren hebben een voordeel omdat ze continue monitoring en controle van het proces mogelijk maken. Deze controlelussen in de microbioreactor bieden ook een toestand die vergelijkbaar is met die op grotere schaal en leveren dus r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland, en het BioProcessing-team van Sartorius Stedim Biotech GmbH, Duitsland, bedanken voor hun steun.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
Riferimenti
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
