عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية
Summary
هنا، نقدم إجراء مفصل لتشغيل تصميم التجربة في مفاعل حيوي صغير آلي يليه حصاد الخلايا وقياس البروتين باستخدام عمود البروتين A.
Abstract
التحسين من العمليات الحيوية لزيادة غلة المنتجات المطلوبة هو من الأهمية في صناعة الأدوية الحيوية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق اختيار السلالة وتطوير معلمات المعالجة الحيوية. وقد استخدمت قوارير الهز لهذا الغرض. ومع ذلك، فإنها تفتقر إلى القدرة على التحكم في معلمات العملية مثل درجة الحموضة والأكسجين المذاب (DO). ويمكن التغلب على هذا القيد بمساعدة مفاعل حيوي صغير آلي. هذه المفاعلات الحيوية تحاكي الزراعة على نطاق أوسع. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا النظام هو دمج تصميم التجربة (وزارة التجارة) في البرنامج. يتيح هذا التكامل إنشاء تصميم حيث يمكن تنوع معلمات العملية المتعددة في وقت واحد. يمكن تحليل معلمات العملية الحرجة وظروف المعالجة الحيوية المثلى داخل البرنامج. التركيز على العمل المعروض هنا هو تعريف المستخدم على الخطوات التي ينطوي عليها تصميم العملية في البرمجيات ودمج وزارة الزراعة ضمن تشغيل الزراعة.
Introduction
بلغت قيمة السوق العالمية للأدوية الحيوية أكثر من 250 مليار دولار أمريكي في عام 2018، وقد توسعت باستمرار1. شركات الأدوية تتحرك بعيدا عن إنتاج الأدوية الجزيئية الصغيرة إلى العلاجات المنتجة تكنولوجيا حيوية مثل البروتينات المؤتلفة. وهذه وحدها مسؤولة عن إيرادات تزيد على 150 بليون دولار1. وتستخدم الآن خلايا الثدييات على نطاق واسع لإنتاج هذه البروتينات الصيدلانية المؤتلفة. في الفترة الحالية ، من بين 68 منتجًا معتمدًا تنتجها خلايا الثدييات ، يتم إنتاج 57 منتجًا بواسطة خلايا مبيض الهامستر الصينية (CHO)2. وتستخدم خلايا CHO خصيصا لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي تتطلب تعديلات ما بعد الترجمة. ويفضل هذه الخلايا لأنها تنمو في تعليق وبالتالي تمكين نتائج قابلة للاستنساخ في مصل المتوسط الحرة المحددة كيميائيا3,4. الميزة الأخرى لاستخدام خلايا CHO هي أن بنية الغليكان للمنتج تشبه بنية الأجسام المضادة أحادية النسيلة البشرية (mAb) وتؤدي إلى زيادة غلة البروتين المؤتلف والإنتاجية المحددة بسبب تضخيم الجينات5.
وقد زاد العائد من المؤتلف CHO (rCHO) ثقافة الخلية بنسبة مائة مرة في العقدين الماضيين. ويعزى هذا التحسن إلى الاستفادة المثلى من معلمات العملية، واستراتيجية التغذية وتطوير مصل خال من المتوسط المحدد كيميائيا6. مع زيادة في متطلبات المنتجات الصيدلانية ، يزيد الضغط على كفاءة التكلفة والوقت لتطوير عملية الإنتاج7. للحد من الضغط مع ضمان جودة المنتج قد أعاد توجيه تركيز صناعة الأدوية على الجودة حسب التصميم (QbD). يتم استخدام QbD لفهم إنتاج المنتج وكذلك العملية. أداة حيوية تستخدم في ObD هو تصميم التجربة (DOE). فهو يساعد على زيادة فهم العملية من خلال الكشف عن العلاقة بين متغيرات الإدخال المختلفة وبيانات الإخراج الناتجة. إن تطبيق نهج وزارة الطاقة لتحسين العملية الحيوية مفيد خلال المراحل المبكرة من المشروع في استيعاب ظروف العملية وزيادة كمية ونوعية التتر. وهذا النهج مفيد بالمقارنة مع الاستراتيجية القديمة: عامل واحد في الوقت الواحد(OFAT). النهج الإحصائية لوزارة التعليم باستخدام الكلاسيكية، الجينين أو تاغوشي هي أعلى بكثير من OFAT8.
يمكن تنفيذ العملية وتحسين الوسائط في قوارير اهتزازية. القوارير غير مكلفة نسبيا. ومع ذلك ، فإنه ليس من الممكن للسيطرة على المعلمات مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والأكسجين المذاب (DO). للتغلب على هذه العيوب، يمكن استخدام المفاعلات الحيوية متعددة الإستعمالات على مقاعد البدلاء التي تتراوح بين حجم العمل من 0.5 لتر إلى 5 لتر. وتوفر المفاعلات رصدا ً واسع النطاق على الإنترنت ومراقبة للعمليات. ومع ذلك ، فإن استخدام المفاعل الحيوي متعدد الإستخدامات هو وقت كثيف وكثيف العمالة. من أجل التغلب على هذه العيوب ، يتم استخدام مفاعل حيوي جديد أحادي الاستخدام يجمع بين العملية الشاملة لمراقبة المفاعل الحيوي على أعلى مقاعد البدلاء وسهولة التعامل مع قارورة الهزة. وقد ساهم نظام فحص الإنتاجية العالية والتكنولوجيا ذات الاستخدام الواحد في تعزيز كفاءة أداء العمليةوتطويرها 9.
في هذه المقالة، يتم سرد المبادئ التوجيهية لتحميل الوصفة في برنامج المفاعل الحيوي الصغير الآلي (AMBR). يتم دراسة تأثير سرعات التحريك المختلفة ودرجة الحموضة على تركيز الخلية القابلة للحياة (VCC) وtiter أثناء هذه التجربة. يتم تنفيذ النتيجة التجريبية والتحليل مع تصميم برنامج التجارب MODDE 12. يتم إجراء تحليلات المنتج في نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط (HPLC) مع عمود بروتين A. وهو يقوم على مبدأ أن منطقة Fc من mAb يربط إلى البروتين A مع تقارب عالية10،11. مع هذه الطريقة، فمن الممكن لتحديد وقياس mAb. يتم تنفيذ القياس الكمي على مناطق الذروة اللاوتية المقاسة في 280 نانومتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن تحسين عملية زيادة العائد أمر بالغ الأهمية في صناعة الأدوية الحيوية. يمكن استخدام قوارير الهز لفحص السلالة. ومع ذلك، مراقبة معلمات العملية مثل درجة الحموضة وDO غير متوفرة في القوارير. وللمفاعلات الحيوية الدقيقة ميزة لأنها تسمح بالرصد المستمر والسيطرة على العملية. هذه الحلقات التحكم في ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا البوندسوزيريوم فور بيلديونغ أوند فورشونج (BMBF)، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث، ألمانيا، وفريق المعالجة الحيوية في سارتوريوس ستيديم للتكنولوجيا الحيوية GmbH، ألمانيا، على دعمهم.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
Riferimenti
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
