Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese
Summary
Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.
Abstract
L’ottimizzazione dei bioprocessi per aumentare la resa dei prodotti desiderati è importante nell’industria biofarmaceutica. Ciò può essere ottenuto mediante la selezione della deformazione e lo sviluppo di parametri di bioprocesso. A questo scopo sono stati utilizzati flaconi Shake. Essi, tuttavia, non sono in grado di controllare i parametri di processo come il pH e l’ossigeno disciolto (DO). Questa limitazione può essere superata con l’aiuto di un microbioreattore automatico. Questi bioreattori imitano la coltivazione su scala più ampia. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è l’integrazione del Design of Experiment (DOE) nel software. Questa integrazione consente di stabilire un progetto in cui più parametri di processo possono essere variati contemporaneamente. I parametri di processo critici e le condizioni ottimali del bioprocesso possono essere analizzati all’interno del software. L’obiettivo del lavoro qui presentato è quello di introdurre l’utente alle fasi coinvolte nella progettazione del processo nel software e nell’incorporazione del DOE all’interno della corsa di coltivazione.
Introduction
Il mercato biofarmaceutico globale ha varato più di 250 miliardi di dollari nel 2018 ed è in continua espansione1. Le aziende farmaceutiche si stanno allontanando dalla produzione di piccoli farmaci molecolari a terapie biotecnologicamente prodotte come le proteine ricombinanti. Questi da soli sono responsabili di un fatturato di oltre 150 miliardi di dollari1. Le cellule dei mammiferi sono ora ampiamente utilizzate per la produzione di queste proteine ricombinanti farmaceutiche. Nel periodo attuale, tra i 68 prodotti approvati prodotti dalle cellule dei mammiferi, 57 sono prodotti dalle cellule ovariche di Hamster cinesi (CHO)2. Le cellule CHO sono specificamente utilizzate per la produzione di proteine ricombinanti che richiedono modifiche post-traduzionali. Queste cellule sono preferite in quanto crescono in una sospensione e quindi consentono risultati riproducibili in unsierolibero chimicamente 3,4. L’altro vantaggio dell’utilizzo di cellule CHO è che la struttura glicana del prodotto assomiglia a quella dell’anticorpo monoclonale umano (mAb) e si traduce in una maggiore resa di proteine ricombinanti e produttività specifica a causa dell’amplificazione della genetion5.
La resa della coltura cellulare ricombinante CHO (rCHO) è aumentata di cento volte negli ultimi due decenni. Questo miglioramento è attribuito all’ottimizzazione dei parametri di processo, alla strategia di alimentazione e allo sviluppo di un mezzo chimico definito chimicamente privo di siero6. Con l’aumento del fabbisogno dei prodotti farmaceutici, la pressione aumenta sull’efficienza dei costi e dei tempi per lo sviluppo del processo di produzione7. Per ridurre la pressione assicurando la qualità del prodotto ha reindirizzato l’attenzione dell’industria farmaceutica sulla qualità di progettazione (QbD). QbD viene utilizzato per comprendere la produzione del prodotto e il processo. Uno strumento vitale utilizzato nell’ObD è il Design of Experiment (DOE). Aiuta ad aumentare la comprensione del processo rivelando la relazione tra varie variabili di input e i dati di output risultanti. L’applicazione dell’approccio DOE per ottimizzare il bioprocesso è vantaggiosa durante le prime fasi del progetto nell’assimilare le condizioni di processo e nell’aumento della quantità e della qualità del titolo. Questo approccio è utile rispetto alla strategia antiquata: OFAT (one-factor-at-a-time). Gli approcci statistici al DOE utilizzando Classico, Shainin o Taguchi sono di gran lunga superiori all’OFAT8.
Il processo e l’ottimizzazione dei supporti possono essere eseguiti in flaconi shake. I flaconi sono relativamente poco costosi. Tuttavia, non è possibile controllare parametri quali temperatura, pH e ossigeno disciolto (DO). Per superare questi inconvenienti, possono essere utilizzati bioreattori multiuso che vanno dal volume di lavoro da 0,5 L a 5 L. I reattori forniscono un ampio monitoraggio on-line e controllo dei processi. Tuttavia, l’uso del bioreattore multiuso è un tempo e un lavoro intensivo. Per superare questi svantaggi, viene utilizzato un nuovo bioreattore monouso che combina il processo completo di monitoraggio del bioreattore bench-top e di facile gestione del pallone di agitazione. Il sistema di screening ad alta produttività e la tecnologia monouso hanno contribuito a migliorare l’efficienza delle prestazioni di processo e dello sviluppo9.
In questo articolo sono elencate le linee guida per caricare la ricetta nel software automatizzato di microbioreattore (AMBR). Nel corso di questo esperimento viene studiata l’influenza delle diverse velocità e del pH sulla concentrazione cellulare vitale (VCC) e sul timore. Il risultato sperimentale e l’analisi vengono effettuati con la progettazione di software sperimentale MODDE 12. L’analisi dei prodotti viene effettuata in un sistema di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con una colonna Protein A. Si basa sul principio che la regione Fc del mAb si lega alla proteina A con alta affinità10,11. Con questo metodo, è possibile identificare e quantificare il mAb. La quantificazione viene effettuata sulle aree di picco di eluizione misurata a 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ottimizzazione del processo per aumentare la resa è di fondamentale importanza nell’industria biofarmaceutica. I flaconi di agitazione potrebbero essere potenzialmente utilizzati per lo screening del ceppo; tuttavia, il monitoraggio dei parametri di processo come pH e DO non sono disponibili nei flaconi. I microreattori hanno un vantaggio in quanto consentono un monitoraggio e un controllo continui del processo. Questi cicli di controllo nel microreattore forniscono anche una condizione simile a quelli su larga scala …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Bundesministerium f’r Bildung und Forschung (BMBF), il Ministero federale dell’istruzione e della ricerca, in Germania, e il team di BioProcessing di Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germania, per il loro sostegno.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
Riferimenti
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