中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化
Summary
ここでは、自動マイクロバイオリアクターで実験計画を実行し、その後にプロテインAカラムを用いた細胞収穫およびタンパク質定量を行う詳細な手順を提示する。
Abstract
バイオプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界において、望ましい製品の収量を増やすために重要です。これは、ひずみの選択とバイオプロセスパラメータの開発によって達成することができます。この目的のために振るフラスコが使用されています。しかし、pHや溶存酸素(DO)などのプロセスパラメータを制御する能力がありません。この制限は、自動化されたマイクロバイオリアクターの助けを借りて克服することができます。これらのバイオリアクターは、より大きなスケールでの栽培を模倣します。このシステムの大きな利点の1つは、実験計画(DOE)をソフトウェアに統合することです。この統合により、複数のプロセスパラメータを同時に変更できる設計を確立できます。重要なプロセスパラメータと最適なバイオプロセス条件は、ソフトウェア内で分析できます。ここで紹介する作業の焦点は、ソフトウェアのプロセス設計に関わるステップと、栽培の過程におけるDOEの組み込みについて、ユーザーに紹介することです。
Introduction
世界のバイオ医薬品市場は2018年に2,500億米ドル以上の価値があり、継続的に拡大しています 1 .製薬会社は、小分子薬の製造から組み換えタンパク質などのバイオテクノロジーで製造された治療薬に移行しています。これらだけでも1,500億ドル以上の収益が1.5億ドルを超える。哺乳動物細胞は現在、これらの医薬組換えタンパク質の生産に広く使用されている。現在の期間において、哺乳動物細胞によって産生される68の承認された製品のうち、57は中国のハムスター卵巣細胞(CHO)2によって産生される。CHO細胞は、翻訳後修飾を必要とする組換えタンパク質の製造に特に使用されます。これらの細胞は、懸濁液中で増殖し、それによって血清フリーの化学的に定義された培地33、44で再現可能な結果を可能にする好ましい。CHO細胞を用いるもう1つの利点は、産物のグリカン構造がヒトモノクローナル抗体(mAb)に類似しており、遺伝子増幅による組換えタンパク質収率および特異的生産性の向上をもたらす5。
組換えCHO(rCHO)細胞培養の収量は、過去20年間で100倍に増加しました。この改善は、プロセスパラメータの最適化、摂食戦略および無血清化学的に定義された培地6の開発に起因する。医薬品の要求の増加に伴い、生産プロセス7の開発のためのコストと時間効率の圧力が高まります。製品品質を保証しながら圧力を軽減するために、製薬業界の焦点は設計品質(QbD)にリダイレクトされました。QbD は、製品の生産とプロセスを理解するために使用されます。ObD で使用される重要なツールは実験の設計 (DOE) です。さまざまな入力変数と結果の出力データの関係を明らかにすることで、プロセスの理解を深めるのに役立ちます。DOEアプローチを適用してバイオプロセスを最適化することは、プロジェクトの初期段階でプロセス条件を同化し、タイターの量と品質を高める上で有益です。このアプローチは、昔ながらの戦略と比較すると有益です: 一時1ファクター (OFAT)。古典、シャイニン、田口を用いたDOEに対する統計的アプローチはOFAT8よりはるかに優れている。
プロセスおよび媒体の最適化は、シェイクフラスコで行うことができる。フラスコは比較的安価です。しかし、温度、pH、溶存酸素(DO)などのパラメータを制御することはできません。これらの欠点を克服するために、0.5 Lから5 Lの働く容積から及ぶ多用のベンチトップバイオリアクターを使用することができる。原子炉は広範なインライン監視およびプロセス制御を提供する。しかし、多用途バイオリアクターの使用は時間と労力を要する。これらの欠点を克服するために、ベンチトップバイオリアクターを監視する包括的なプロセスとシェイクフラスコの容易な取り扱いを組み合わせた新しい単回使用バイオリアクターが使用されています。高スループットスクリーニングシステムとシングルユース技術は、プロセス性能と開発の効率を高める9.
この記事では、自動マイクロバイオリアクター(AMBR)ソフトウェアにレシピをロードするためのガイドラインをリストします。異なる攪拌機の速度とpHが生存細胞濃度(VCC)および力乗に及ぼす影響は、この実験の過程で検討される。実験結果及び分析は、実験用ソフトウェアMODDE12の設計を用いて行う。製品分析は、プロテインAカラムを備えた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)システムで行われます。mAbのFc領域は、高親和性10,11,11のプロテインAに結合するという原理に基づいている。この方法により、mAbを同定し定量することができる。定量は、280nmで測定された溶出ピーク領域上で行われる。
Protocol
Representative Results
Discussion
収量を増やすためにプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界で非常に重要です。シェイクフラスコは、潜在的に株のスクリーニングに使用することができます。ただし、pH や DO などのプロセス パラメータの監視はフラスコでは使用できません。マイクロバイオリアクターは、プロセスの継続的な監視と制御を可能にする利点があります。マイクロバイオリアクターにおけるこれらの制御ル?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ドイツの連邦教育研究省(BMBF)、ドイツのサルトリウス・ステディム・バイオテック社のバイオプロセッシングチームの支援に感謝したいと考えています。
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
Riferimenti
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