Prøveforberedelse i kvartskrystall Mikrovekt målinger av protein absorpsjon og polymer mekanikk

Summary

Kvartskrystall mikrovekt kan gi nøyaktige masse og viskoelastiske egenskaper for filmer i mikron eller submikron rekkevidde, som er relevant for undersøkelser i biomedisinsk og miljømessig sensing, belegg, og polymer vitenskap. Prøve tykkelsen påvirker hvilken informasjon som kan fås fra materialet som er i kontakt med sensoren.

Abstract

I denne studien presenterer vi ulike eksempler på hvordan tynn film forberedelse for kvartskrystall mikrovekt eksperimenter informerer riktig modellering av data og bestemmer hvilke egenskaper av filmen kan være kvantifisert. Den kvartskrystall mikrovekt tilbyr en unikt følsom plattform for måling av fine endringer i masse og/eller mekaniske egenskaper av en anvendt film ved å observere endringene i mekanisk resonans av en kvartskrystall svingte på høy frekvens. Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer sin eksperimentelle allsidighet, evne til å studere endringer i egenskaper over et bredt spekter av eksperimentelle tids lengder, og bruk av små utvalgsstørrelser. Vi viser at, basert på tykkelsen og skjær modul av laget avsatt på sensoren, kan vi tilegne seg forskjellig informasjon fra materialet. Her er dette konseptet spesielt utnyttet til å vise eksperimentelle parametre som resulterer i masse og viskoelastiske beregninger av adsorberes kollagen på gull og polyelectrolyte komplekser under hevelse som en funksjon av saltkonsentrasjon.

Introduction

Kvartskrystall mikrovekt (QCM) utnytter den Piezoelektriske effekten av en kvartskrystall for å overvåke dens resonans frekvens, som er avhengig av massen levd opp til overflaten. Teknikken sammenligner resonans frekvens og båndbredde på en AT cut kvartskrystall sensor (vanligvis i størrelsesklasse av 5 MHz)¹ i luft eller en væske til frekvens og båndbredde på sensoren etter deponering av en film. Det er flere fordeler for å bruke QCM å studere tynne filmegenskaper og grensesnitt, inkludert høy følsomhet for masse og potensielt til viskoelastiske eiendom endringer (avhengig av prøve ensartethet og tykkelse), evnen til å utføre studier in situ², og evnen til å granske en mye kortere reologiske tidsskala enn tradisjonell skjær Reologi eller dynamisk mekanisk analyse (DMA). Hvis du undersøker en kort reologiske tidsskala, kan du observere hvordan responsen på denne tidsskalaen endres både over ekstremt korte (MS)³ og lange (år) varigheter⁴. Denne evnen er gunstig for studiet av en rekke kinetisk prosesser og er også en nyttig forlengelse av tradisjonelle rheometric teknikker^5,6.

Den høye følsomheten til QCM har også ført til utstrakt bruk i biologiske anvendelser som studerer de grunnleggende interaksjoner av ekstremt små biomolekyler. En ubehandlede eller funksjonalisert sensor overflate kan brukes til å undersøke protein absorpsjon. ytterligere, biosensing gjennom komplekse bindende hendelser mellom enzymer, antistoffer og aptamers kan undersøkes basert på endringer i masse^7,8,9. For eksempel har teknikken blitt brukt til å forstå transformasjonen av blemmer til en Planar lipid bilayer som en to-fase prosess med absorpsjon av væske som inneholder blemmer til en stiv struktur ved å observere samkjøre endringer i frekvens og viscoelasticity¹⁰. I de senere årene har QCM i tillegg tilbudt en robust plattform for å overvåke narkotika levering med blemmer eller nanopartikler¹¹. I skjæringspunktet mellom materialer engineering og molekylær og cellulær biologi, kan vi bruke QCM å belyse viktige interaksjoner mellom materialer og bioaktive komponenter som proteiner, nukleinsyre syrer, liposomer, og celler. For eksempel, protein absorpsjon til en biomaterialet formidler nedstrøms cellulære reaksjoner som betennelse og brukes ofte som en positiv indikator på biokompatibilitet, mens i andre tilfeller ekstracellulære protein vedlegg til belegg som grensesnitt med blod kan indusere farlig blodpropp i fartøy^12,13. QCM kan derfor brukes som et verktøy for å velge kandidater som er optimale for ulike behov.

To vanlige tilnærminger for utføring av QCM-eksperimenter samler inn analoge data fra eksperimentet: den første tilnærmingen registrerer frekvens forskyvningen og halv båndbredden (Γ) for konduktans topp. Den andre tilnærmingen, QCM med spredning (QCM-D), registrerer frekvensen Skift og spredning faktor, som er direkte proporsjonal med Γ gjennom ligningen 1,¹⁴

1

der D er sprednings faktoren og ƒ er frekvensen. Både D og Γ er relatert til dempingen effekten filmen har på sensoren, som gir en indikasjon på stivhet av filmen. Den senket n betegner frekvensen overtone eller harmonisk, som er odde resonans frekvenser av kvarts sensor (n = 1, 3, 5, 7…). Videre drøfting av modeller som bruker flere harmoniske for å oppnå masse og viskoelastiske egenskaper av en film kan bli funnet i en gjennomgang av Johannsmann¹⁴ og tidligere papirer fra Shull Group^15,16,17,18.

En viktig faktor for å forberede QCM prøvene er hvordan man bruker den tynne filmen på sensoren overflaten. Noen vanlige metoder omfatter spin-belegg, dip-belegg, dråpe belegg eller absorpsjon av filmen på sensor overflaten under eksperimentet^19,20. Det er fire regioner for QCM prøver: Sauerbrey grense, viskoelastiske regime, bulk regimet, og overdamped regime. For tilstrekkelig tynne filmer, Sauerbrey grensen gjelder, hvor frekvensen Skift (Δƒ) gir overflaten masse tetthet av filmen. Innenfor Sauerbrey grensen skalerer frekvens skiftet lineært med den resonans harmoniske, n, og endringer i demping faktor (D eller Γ) er generelt små. I dette regimet er tilstrekkelig informasjon ikke er tilgjengelig for å entydig bestemme reologiske egenskaper av laget uten å gjøre flere forutsetninger. Data i dette regimet brukes til å beregne overflaten masse tetthet (eller tykkelse hvis tettheten er kjent a priori) av filmen. I bulk regime der mediet i kontakt med krystallen er tilstrekkelig tykk, evanescent skjær bølgen sprer seg inn i mediet før de blir helt dempet. Her kan ingen masse informasjon fås ved hjelp av Δƒ. Men i denne regionen, viskoelastiske egenskaper er pålitelig bestemmes ved hjelp av kombinasjonen av Δƒ og ΔΓ ^15,18. I bulk regime, hvis mediet er for rigid, vil filmen fuktig ut resonans av sensoren, hindrer innsamling av eventuelle pålitelige data fra QCM. Viskoelastiske regime er det mellomliggende regimet hvor filmen er tynn nok til å ha skjær bølgen fullt spredd gjennom filmen, samt har pålitelige verdier for demping faktor. Den demping faktor og Δƒ kan deretter brukes til å bestemme viskoelastiske egenskapene til filmen så vel som sin masse. Her er viskoelastiske egenskaper gitt av produktet av tettheten og omfanget av den komplekse skjær modul | G* | p og fasevinkelen gitt av Φ = ARCTAN (g “ / G”). Når filmer er utarbeidet i Sauerbrey grensen, kan massen per enhet området beregnes direkte basert på Sauerbrey ligningen vist under²¹,

2

hvor Δƒ_n er endringen i resonans frekvens, n er overtone av interesse, ƒ₁ er resonans frekvensen av sensoren, Δm / A er massen per område av filmen, og Z_q er akustisk impedans i kvarts, som for kutte kvarts er Z_q = 8,84 x 10⁶kg / m²s. Den viskoelastiske regimet er mest hensiktsmessig for studiet av polymer filmer, og bulk grensen er nyttig for å studere viskøs polymer²² eller protein løsninger¹⁶. De ulike regimer avhenger av egenskapene til materialet av interesse, med optimal tykkelse for full viskoelastiske og masse karakterisering generelt øker med film stivhet. Figur 1 beskriver de fire regionene med hensyn til areal tettheten i filmen, kompleks skjær-modul og fase vinkel, der vi har antatt en bestemt sammenheng mellom fasevinkelen og film stivheten som er vist å være relevant for materialer av denne typen. Mange filmer av praktisk interesse er for tykke for å studere viskoelastiske egenskaper med QCM, slik som visse biofilm, hvor tykkelser er på rekkefølgen av titalls til hundrevis av mikron²³. Slike tykke filmer er vanligvis ikke hensiktsmessig for å studere ved hjelp av QCM, men kan måles ved hjelp av mye lavere frekvens resonatorer (som vridnings resonatorer)²³, slik at skjær bølgen til videreføres videre inn i filmen.

For å finne ut hvilket regime som er relevant for en gitt QCM prøve, er det viktig å forstå d /λ_n -parameteren, som er forholdet mellom filmtykkelsen (d) og skjær bølgelengden til den mekaniske bevegelse av kvartskrystall sensoren (λ_n)^15,16,18. Det ideelle viskoelastiske-regimet er d /λ_n = 0,05-0,2¹⁸, der verdier under 0,05 er innenfor Sauerbrey grense og verdier over 0,2 nærmer seg bulk regimet. En mer grundig beskrivelse av d /λ_n er gitt andre steder^15,18, men det er en kvantitativ parameter opptegning Sauerbrey grensen og viskoelastiske grensen. Analyse programmene som brukes nedenfor, gir denne parameteren direkte.

Det er noen flere begrensninger for å analysere tynne filmer med QCM. Sauerbrey-og viskoelastiske-beregningene forutsetter at filmen er homogen både gjennom hele filmtykkelsen og sideveis over elektrode overflaten på QCM. Mens denne antakelsen gjør det utfordrende å studere filmer som har hulrom eller fyllstoffer stede, har det vært noen QCM undersøkelser i filmer bestående av podet nanopartikler⁶. Hvis heterogeniteter er små i forhold til den totale filmtykkelsen, kan pålitelig viskoelastiske egenskapene til det sammensatte systemet fortsatt fås. For mer heterogene systemer, verdier innhentet fra en viskoelastiske analyse bør alltid sees med stor forsiktighet. Ideelt sett bør resultater fra systemer med ukjente heterogenitet valideres mot systemer som er kjent for å være homogene. Dette er den tilnærmingen vi har tatt i eksempelet systemet beskrevet i denne utredningen.

Et viktig poeng som vi illustrerer i denne utredningen er nøyaktig korrespondanse mellom QCM målinger gjort i frekvens domene (der Γ er rapportert) og tids domene eksperimenter (der D er rapportert). Resultater fra to forskjellige QCM-eksperimenter, en gangs domene og ett frekvens domene, er beskrevet, som hver involverer et annet, men konseptuelt relatert modell system. Det første systemet er et enkelt eksempel på kollagen vedlegg til sensoren for å illustrere representative bindende Kinetics og likevekts av absorpsjon over tid under en tids domene (QCM-D) måling. Kollagen er den mest tallrike protein i kroppen, kjent for sin allsidighet av bindende atferd og morfologi. Kollagen løsningen som brukes her, krever ikke ytterligere funksjonalisering av sensorens gull overflate for å indusere absorpsjon⁹. Den andre eksperimentelle systemet er en polyelectrolyte kompleks (PEC) består av anioniske polystyren kalsiumalkarylsulfonat (PSS) og kationiske Poly (diallyldimethylammonium) (PDADMA) utarbeidet på samme måte som Sadman et al.²². Disse materialene hovne opp og bli myk i salt (KBr i dette tilfellet) løsninger, og tilbyr en enkel plattform for å studere polymer mekanikk ved hjelp av en frekvens domene tilnærming (QCM-Z). For hver protokoll vises prosessen med å klargjøre, ta og analysere et mål i figur 2. Den Skjematisk viser at den største forskjellen mellom QCM-Z og QCM-D tilnærminger er i datainnsamling trinn og instrumentering som brukes i eksperimentet. Alle de nevnte prøve Forberedelses teknikkene er kompatible med begge tilnærminger, og hver tilnærming kan analysere prøvene i de tre regionene avbildet i figur 1.

Våre data viser at utarbeidelse av prøver, enten ved sensor belegg før eller under en måling, dikterer evnen til å trekke ut de viskoelastiske egenskapene til et system. Ved å utforme de tidlige stadiene av et eksperiment på riktig måte, kan vi finne ut hvilken informasjon vi kan samle inn nøyaktig i løpet av analyse trinnet.

Protocol

QCM-D kollagen absorpsjon 1. prøveklargjøring og sensor forhånds rensing Forbered 20 mL av 0,1 M acetate buffer, justere pH med HCl og NaOH som nødvendig for å oppnå pH = 5,6. Legg Rat tail kollagen løsning til 20 mL av acetate buffer under sterile forhold til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Rengjør den gull belagte kvarts sensoren for å fjerne organisk og biologisk materiale25,…

Representative Results

Endringer i hyppighet med tid under absorpsjon av protein viser en karakteristisk kurve og et platå som er vist i Figur 3a-B. Den innledende buffer vask av 1x PBS over den nakne sensoren overflaten induserer bare ubetydelige endringer i frekvens, og tilbyr en jevn baseline å fungere som en referanse for fremtidige datapunkter. Innføringen av kollagen løsning fører til at protein absorpsjon begynner, observert som en jevn nedgang i frekvens over tid, inntil tettheten av …

Discussion

Absorpsjons resultatene for kollagen spenner over Sauerbrey-og viskoelastiske-regimer. Ved å plotte frekvensen Skift normalisert til tilsvarende harmonisk tall, observerer vi at Sauerbrey grensen gjelder for omtrent de første 2 h av målingen. Med økende masse å følge sensoren, men den normalisert frekvens Skift for tredje og femte harmoniske begynner å avvike fra hverandre (t > 2 h), som indikerer en evne til å bestemme viskoelastiske egenskaper av adsorberes film.

En direkte …

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling