Protein Adsorpsiyon ve Polimer Mekaniğinin Kuvars Kristal Mikroterazi Ölçümlerinde Örnek Hazırlama
Summary
Kuvars kristal mikrodengesi mikron veya submikron aralığındaki filmler için doğru kütle ve viskoelastik özellikler sağlayabilir, bu da biyomedikal ve çevresel algılama, kaplama ve polimer bilimi araştırmalarına yöneliktir. Numune kalınlığı, sensörle temas eden malzemeden elde edilebilen bilgileri etkiler.
Abstract
Bu çalışmada, kuvars kristal mikrodenge deneyleri için ince film hazırlığının verilerin uygun modellemesini nasıl bilgilendirdiğini ve filmin hangi özelliklerinin ölçülebileceğini nasıl belirlediğine çeşitli örnekler savuruyoruz. Kuvars kristal mikrodengesi, yüksek frekansta salınım sağlayan bir kuvars kristalinin mekanik rezonansındaki değişiklikleri gözlemleyerek uygulanan bir filmin kütlesi ndeki ve/veya mekanik özelliklerindeki ince değişiklikleri ölçmek için benzersiz hassas bir platform sunar. Bu yaklaşımın avantajları arasında deneysel çok yönlülüğü, çok çeşitli deneysel zaman uzunlukları üzerindeki özelliklerindeki değişiklikleri inceleme yeteneği ve küçük örneklem boyutlarının kullanımı sayılabilir. Sensöre yatırılan tabakanın kalınlığı ve kesme modülüne dayanarak malzemeden farklı bilgiler elde edebileceğimizi gösteriyoruz. Burada, bu kavram özellikle tuz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak şişme sırasında altın ve polielektrolit kompleksleri üzerinde adsorbe kollajen kütle ve viskoelastik hesaplamaları ile sonuçlanan deneysel parametreleri görüntülemek için istismar edilir.
Introduction
Kuvars kristal mikrodengesi (QCM), yüzeye yapışan kütleye bağlı olan rezonans frekansını izlemek için kuvars kristalinin piezoelektrik etkisinden yararlanır. Teknik, bir AT kesim kuvars kristal sensörünün (genellikle 5 MHz aralığında)1’in rezonans frekansını ve bant genişliğini, bir filmin birikmeden sonra sensörün frekansı ve bant genişliğiyle karşılaştırır. İnce film özellikleri ve arayüzleri incelemek için QCM’yi kullanmanın çeşitli yararları vardır, buna kütleye karşı yüksek duyarlılık ve viskoelastik özellik değişikliklerine potansiyel olarak (örnek tekdüzelik ve kalınlığa bağlı olarak), yerinde2’deçalışmalar yapabilme ve geleneksel kesme romatolojisinden veya dinamik mekanik analizden (DMA) çok daha kısa bir romatolojik zaman ölçeğini araştırma yeteneği de dahil olmak üzere. Kısa bir reolojik zaman ölçeğini araştırmak, bu zaman ölçeğindeki yanıtın hem son derece kısa (ms)3 hem de uzun (yıl) süreler4’tenasıl değiştiğini gözlemlemeyi sağlar. Bu yetenek kinetik süreçlerin çeşitli çalışma için yararlı ve aynı zamanda geleneksel reometrik teknikleri yararlı bir uzantısıdır5,6.
QCM’nin yüksek hassasiyeti, son derece küçük biyomoleküllerin temel etkileşimlerini inceleyen biyolojik uygulamalarda da yoğun kullanımına yol açmıştır. Bir kaplamasız veya fonksiyonel sensör yüzeyi protein adsorpsiyon araştırmak için kullanılabilir; daha da, enzimler arasında karmaşık bağlanma olayları ile biosensing, antikorlar, ve aptamers kütle değişiklikleri dayalı incelenebilir7,8,9. Örneğin, bu teknik, sıvı içeren veziküllerin sert bir yapıya adsorpsiyonunun iki aşamalı bir işlem olarak düzlemsel lipid çift katmanlı hale dönüşümünün, frekans ve viskoelastisitedeki değişiklikleri gözlemleyerek anlaşılması için kullanılmıştır10. Son yıllarda, QCM ayrıca veziküller veya nano tanecikleri11tarafından ilaç dağıtımını izlemek için sağlam bir platform sundu. Malzeme mühendisliği ile moleküler ve hücresel biyolojinin kesiştiği noktada, qcm’yi malzemeler ve proteinler, nükleik asitler, lipozomlar ve hücreler gibi biyoaktif bileşenler arasındaki temel etkileşimleri açıklamak için kullanabiliriz. Örneğin, bir biyomateryale protein adsorpsiyonu inflamasyon gibi hücresel yanıtları aşağı aracılık eder ve genellikle biyouyumluluğun olumlu bir göstergesi olarak kullanılırken, diğer durumlarda kanla arabirim infilak eden kaplamalara hücre dışı protein eki damarlarda tehlikeli pıhtılaşmaya neden olabilir12,13. BU nedenle QCM, farklı ihtiyaçlar için en uygun adayları seçmek için bir araç olarak kullanılabilir.
QCM denemelerinin gerçekleştirmek için iki yaygın yaklaşımı deneyden benzer veriler toplar: ilk yaklaşım, iletkenlik zirvesinin frekans değişimini ve yarım bant genişliğini(Γ)kaydeder. İkinci yaklaşım, QCM dağılım (QCM-D), frekans kayması ve denklem 1,14 ile Γ ile doğru orantılı dağılım faktörü kaydeder
(1)
D dağılma faktörü ve ƒ frekansı dır. Hem D hem de Γ, filmin sensör üzerindeki sönümleme etkisiyle ilişkilidir ve bu da filmin sertliğinin bir göstergesidir. Subscript n kuvars sensörü (n = 1, 3, 5, 7…) tek rezonans frekansları olan frekans overtone veya harmonik, gösterir. Bir filmin kütle ve viskoelastik özelliklerini elde etmek için birden fazla harmonik kullanarak modellerin daha fazla tartışma Johannsmann tarafından bir inceleme bulunabilir14 ve Shull grup önceki kağıtları15,16,17,18.
QCM örnekleri nin hazırlanmasında göz önünde bulundurulması gereken en önemli noktalardan biri, ince filmin sensör yüzeyine nasıl uygulanacağıdır. Bazı yaygın yöntemler spin kaplama, daldırma kaplama, damla kaplama, ya da deneme sırasında sensör yüzeyine filmin adsorpsiyoniçerir 19,20. QCM örnekleri için dört bölge vardır: Sauerbrey sınırı, viskoelastik rejim, dökme rejim ve aşırı damped rejimi. Yeterince ince filmler için, Frekans kayması(Δƒ) filmin yüzey kütle yoğunluğunu sağladığı Sauerbrey sınırı uygulanır. Sauerbrey limiti içinde, frekans kayması rezonans harmonik ile doğrusal ölçekler, n, ve sönümleme faktörü değişiklikleri(D veya Γ) genellikle küçüktür. Bu rejimde ek varsayımlar yapmadan katmanın reolojik özelliklerini benzersiz olarak belirlemek için yeterli bilgi mevcut değildir. Bu rejimdeki veriler, filmin yüzey kütlesi yoğunluğunu (veya yoğunluğu bilinen a prioriise kalınlığı) hesaplamak için kullanılır. Kristalle temas eden ortamın yeterince kalın olduğu dökme rejimde, yarıcı kesme dalgası tamamen nemlendirilmeden önce ortama yayılır. Burada Δƒ kullanılarak hiçbir kütle bilgisi elde edilemez. Ancak, bu bölgede viskoelastik özellikler Δ ƒ ƒ ve ΔΓ 15, 18kombinasyonu kullanılarak güvenilir bir şekilde belirlenir. Dökme rejimde, ortam çok sertse, film sensörün rezonansını nemli olarak nemlandırarak QCM’den güvenilir verilerin toplanmasını önler. Viskoelastik rejim, filmin kesme dalgasının film boyunca tam olarak yayılmasını ve sönümleme faktörü için güvenilir değerlere sahip olmasını sağlamak için yeterince ince olduğu ara rejimdir. Sönümleme faktörü ve Δƒ daha sonra filmin viskoelastik özelliklerini ve kütlesini belirlemek için kullanılabilir. Burada, viskoelastik özellikleri yoğunluk ve karmaşık kesme modülü büyüklüğü ürünü tarafından verilir | G*| p ve Φ = arctan(G” / G’tarafından verilen faz açısı). Filmler Sauerbrey sınırında hazırlandığında, birim alan başınakütle, 21’inaltında gösterilen Sauerbrey denklemine göre doğrudan hesaplanabilir.
(2)
δƒn rezonans frekansındaki değişim, n ilginin overton, ƒ1 sensörün rezonans frekansı, Δm / A filmin alan başına kütle, ve Zq kuvars akustik empedans, AT kesme kuvars için Zq = 8.84 x 106kg / m2s. Viskoelastik rejim polimer filmlerinin incelenmesi için en uygundur ve hacim sınırı viskoz polimer22 veya protein çözeltilerinin incelenmesi için yararlıdır16. Farklı rejimler, tam viskoelastik ve kütle karakterizasyonu için optimum kalınlık genellikle film sertliği ile artan ilgi malzemenin özelliklerine bağlıdır. Şekil 1, bu tür malzemelerle ilgili olduğu gösterilen faz açısı ile film sertliği arasında belirli bir ilişki varsaydığımız filmin areal yoğunluğu, karmaşık kesme modülü ve faz açısı na göre dört bölgeyi tanımlar. Pratik ilgi birçok film qcm ile viskoelastik özellikleri incelemek için çok kalın, bazı biyofilmler gibi, kalınlıkları mikron yüzlerce onlarca sırada olduğu23. Bu tür kalın filmler genellikle QCM kullanarak çalışma için uygun değildir, ancak çok daha düşük frekanslı rezonatörler kullanılarak ölçülebilir (burulma rezonatörleri gibi)23, kesme dalgası film içine daha fazla yaymak için izin.
Belirli bir QCM numunesi için hangi rejimin uygun olduğunu belirlemek için, film kalınlığının(d)kuvars kristal sensörünün mekanik salınımının (λn) 15,16,18’eoranı olan d / λn parametresini anlamak önemlidir. İdeal viskoelastik rejim d / λn = 0,05 – 0,218‘ dir, 0,05’in altındaki değerlerin Sauerbrey limiti içinde olduğu ve 0,2’nin üzerindeki değerlerin kütle rejimine yaklaştığı yerdir. D / λn daha titiz bir açıklama başka bir yerde sağlanır15,18, ama sauerbrey sınırı ve viskoelastik sınırı delineating bir nicel parametre. Aşağıda kullanılan analiz programları bu parametreyi doğrudan sağlar.
QCM ile ince filmleri analiz etmek için bazı ek sınırlamalar vardır. Sauerbrey ve viskoelastik hesaplamalar filmin hem film kalınlığı boyunca hem de YANAL QCM elektrot yüzeyinde homojen olduğunu varsayar. Bu varsayım boşluklar veya dolgu mevcut olan filmleri incelemek için zor olsa da, aşılı nano tanecikleri oluşan filmlere bazı QCM araştırmalar olmuştur6. Heterojenlikler genel film kalınlığına göre küçükse kompozit sistemin güvenilir viskoelastik özellikleri elde edilebilir. Daha heterojen sistemler için viskoelastik analizden elde edilen değerler her zaman dikkatle görülmelidir. İdeal olarak, heterojenliği bilinmeyen sistemlerden elde edilen sonuçlar homojen olduğu bilinen sistemlere karşı doğrulanmalıdır. Bu yazıda açıklanan örnek sistemde aldığımız yaklaşım budur.
Bu yazıda gösterdiğimiz önemli bir nokta, frekans etki alanında (Γ’in raporlandığı yer) QCM ölçümleri ile zaman etki alanı deneyleri (D’nin raporlandığı) arasındaki tam yazışmadır. Her biri farklı ama kavramsal olarak ilişkili bir model sistemi içeren iki farklı QCM deneyinin, bir kez etki alanının ve bir frekans etki alanının sonuçları açıklanmıştır. İlk sistem bir zaman etki alanı (QCM-D) ölçümü sırasında temsili bağlayıcı kinetik ve zaman içinde adsorpsiyon denge göstermek için sensörkolajen eki basit bir örnektir. Kollajen vücutta en bol protein, bağlayıcı davranışlar ve morfoloji onun çok yönlülük için bilinir. Burada kullanılan kollajen çözeltisi adsorpsiyon9neden sensörün altın yüzeyinin ek işlevselleştirme gerektirmez. İkinci deneysel sistem, anyonik polistiren sülfonat (PSS) ve katyonik poli (diallyldimethylamumumum) (PDADMA) tarafından Sadman ve ark.22ile aynı şekilde hazırlanmış polielektrolit kompleksidir .22 . Bu malzemeler şişip tuz (bu durumda KBr) çözeltilerinde yumuşak hale gelir, polimer mekaniğinin bir frekans etki alanı yaklaşımı (QCM-Z) kullanılarak incelenmesi için basit bir platform sunar. Her protokol için, bir ölçümün hazırlanması, alınması ve analiz iå lemi Å il 2′de gösterilmiştir. Şema, QCM-Z ve QCM-D yaklaşımları arasındaki temel farkın veri toplama adımı nda ve deneyde kullanılan enstrümantasyonolduğunu gösterir. Belirtilen tüm numune hazırlama teknikleri her iki yaklaşımla da uyumludur ve her yaklaşım Şekil 1’degösterilen üç bölgede örnekleri analiz edebilir.
Verilerimiz, numunelerin bir ölçümden önce veya ölçüm sırasında sensör kaplaması ile hazırlanmasının, bir sistemin viskoelastik özelliklerini ayıklama yeteneğini gerektirdiğini göstermektedir. Bir deneyin erken aşamalarını uygun şekilde tasarlayarak, analiz adımı sırasında hangi bilgileri doğru bir şekilde toplayabileceğimizi belirleyebiliriz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kollajen adsorpsiyon sonuçları Sauerbrey ve viskoelastik rejimleri kapsar. Normalleştirilmiş frekans kaymalarını ilgili harmonik sayıya göre çizerek, Sauerbrey limitinin ölçümün yaklaşık ilk 2 saatiçin geçerli olduğunu gözlemliyoruz. Ancak sensöre artan kütle yapışmasıyla, üçüncü ve beşinci harmonikler için normalleştirilmiş frekans değişimleri birbirlerinden sapmaya başlar(t > 2 h), adsorbe filmin viskoelastik özelliklerini belirleme yeteneğini gösterir.
<p class="jove_…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NSF (DMR-1710491, OISE-1743748) tarafından desteklenmiştir. J.R. ve E.S. NSF’nin (DMR-1751308) desteğini kabul eder.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
Riferimenti
- Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution – Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
- Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
- Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
- Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
- Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
- Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
- Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
- Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
- Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
- Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
- Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
- Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
- Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
- Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
- Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists’ paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
- Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
- Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
- Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
- Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
- Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
- Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , (2017).
- Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , (2015).
- Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
- Sadman, K. . sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).
