내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대
Summary
여기에서 우리는 창자 호밍 조절 T 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA) 드 노보의 고농도를 국부적으로 생산하도록 설계되었습니다.
Abstract
염증성 장 질환 (IBD) 위장관에서 염증성 만성 질환 (GUT). 미국에서는, 대략 1.4 백만 IBD 환자가 있습니다. 창자 박테리아에 dysregulated 면역 반응이 질병을 시작하고 점막 상피 장벽을 중단한다는 것은 일반적으로 받아들여집니다. 우리는 최근에 창자 homing 규제 T (Treg) 세포가 IBD를 위한 유망한 치료이다는 것을 보여줍니다. 따라서, 이 문서는 내장-호밍 트레그 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 두 분자 데 노보, 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA)의 국소 고농도를 생산하도록 설계되었습니다. 우리는 1,25(OH)2D가 조절 분자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 이전 연구 결과에 기초하여 1,25(OH)2D 및 RA를 선택하였다(예를 들어, 포크헤드 박스 P3 및 인터류키틴-10)와 RA가 T 세포에서 장-호밍 수용체의 발현을 자극할 수 있다. 이러한 엔지니어링 수지상 세포를 생성하기 위해, 우리는 두 개의 유전자를 과발현하기 위해 수지상 세포를 트랜스듀싱하는 렌티 바이러스 벡터를 사용합니다. 한 유전자는 1,25(OH)2D의 합성을 생리적으로 촉매하는 25-하이드록시비타민 D 1α-하이드록실라아제를 암호화하는 시토크롬 P450 패밀리 27서브패밀리 B부재 1종이다. 다른 유전자는 생리학적으로 RA의 합성을 촉매하는 망막알데히드 탈수소효소 2를 암호화하는 알데히드 탈수소효소 1가족 구성원 A2이다. 이 프로토콜은 생체 내에서 장-호밍 트레그 세포의 향후 조사에 사용될 수 있다.
Introduction
염증성 장 질환 (IBD) 위장관에서 염증성 만성 질환 (GUT). 미국에서는, 대략 1.4 백만 IBD 환자가 있습니다. 장내 세균에 대한 이질관계가 있는 면역 반응이 질병을 개시하고 점막 상피 장벽을 방해하는 것이 일반적으로 받아들여진다1,2. 이러한 이유로, 현재 사용할 수 있는 미국 식품 의약국 (FDA) 승인 약물 염증 중재자의 기능을 억제 하거나 창 자에 면역 세포의 homing차단. 그러나, 표적으로 하는 선동적인 매개체 및 면역 세포는 또한 면역 방어를 위해 필요합니다. 그 결과, 염증성 중개제 억제제는 전신 면역 방어를 손상시키고 면역 세포 호밍 차단제는 장 내 면역 방어를 약화시키고, 둘 다 심각한 결과를 초래할 수 있다3,4. 또한, 면역 세포 호밍 차단제는 또한 장내로 규제 T (Treg) 세포의 호밍을 차단할 수 있으며, 따라서 IBD 환자에서 이미 손상된 장 면역 내성을 악화시킬 수 있습니다. 더욱이, 창자에 있는 Treg 세포의 차단은 또한 혈액에 있는 Treg 세포의 축적 때문에 전신 면역 억제로 이끌어 낼 수 있습니다5. 마지막으로, 억제제와 차단제는 일시적으로 기능하므로 빈번한 투여가 필요합니다. 이러한 억제제 및 차단제의 빈번한 투여는 불리한 부작용을 더욱 악화시킬 수 있다.
최근, 우리는 잠재적으로 완화 하거나 IBD 치료에 대 한 현재 약물과 관련 된 부작용을 제거 할 수 있는 새로운 전략을 제안6. 이 전략은 말초 림프 조직에 있는 창자 homing Treg 세포의 유도를증강합니다 6. 이 전략의 근거는 창 자-homing Treg 세포 특히 창 자에 가정 하 고 따라서 전신 면역 방어를 손상 하지 않습니다. 또한, Treg 세포는 잠재적으로메모리를형성할 수 있기 때문에7,8,창자-호밍 트레그 세포는 잠재적으로 IBD 환자에서 만성 장 염증의 안정적인 제어를 제공할 수 있으며, 따라서, 치료는 자주 투여될 필요가 없다. 더욱이, 이 전략은 생체 내에서 장-호밍 트레그 세포의 유도를 증가시키기 때문에, 시험관내 생성 된 Treg 세포의 채택 전이와 관련된 고도로 전염하는 환경에서 생체 내 불안정성에 대한 우려가 없다9,10. 이와 관련하여, 시험관내 생성 트레그 세포는 자가면역 질환의 치료를 위한 제안된 전략 중하나(11,12, 13및 이식거부14,15)이다. 마지막으로, 이 전략에서 수지상 세포(DC)는 활성 비타민 D(1,25-디하이드록시비타민 D 또는 1,25[OH]2D)및 활성 비타민 A(레티노산 또는 RA)의 두 분자의 국소 고농도를 생산하도록 설계되었습니다. 1,25(OH) 2D는 조절 분자의 발현을 유도할 수 있기 때문에 1,25(OH)2D(예를 들어, 포크헤드 박스 P3[foxp3]] 및 인터류핀-10[IL-10]))(16, 17 및 RA가 T 세포 18에서 장-호밍 수용체의 발현을 자극할 수 있기때문이다.18). 1,25(OH)2D와 RA 모두 DC28,29를견딜 수 있기 때문에, 우리는 엔지니어링된 DC가 생체 내에서 내성 상태로 안정적으로 유지될 것이고, 따라서 생체외 에서 생성된 톨레생성 DC(TolDCs)19,20, 21을우회할 수 있는 이유이다. 이러한 점에서, TolDC는 또한 Treg 세포 기능19,20,21의생체 내 증강을 위한 제안된 전략 중 하나이다. 우리의 추론을 지원하기 위해, 우리는 생체 내 납품시 엔지니어링 된 DC가 말초 림프 조직에서 창자 호밍 Treg 세포의 유도를 증가 시킬 수 있음을 보여주었습니다6.
우리의 제안된 전략의 추가 이점은 1,25 (OH)2D는 또한 IBD 환자를 잠재적으로 유익할 수 있는 그밖 기능이 있다는 것입니다. 이러한 다른 기능은 항균제(22)의 분비를 자극하고 발암을 억제하는 1,25(OH)2D의능력을 포함한다. 감염 및 암은 IBD24,25와자주 연관됩니다.
1,25(OH)2D 및 RA de novo 의 국소 고농도를 생성할 수 있는 DC를 생성하기 위해, 우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 DC를 설계하여 두 개의 유전자를 과발현한다. 한 유전자는 25-하이드록시비타민 D 1α-하이드록실라제(1α-hydroxylase)를 암호화하는 시토크롬 P450 패밀리 27서브패밀리 B부재 1(CYP27B1)으로, 생리적으로 1,25(OH)2D의합성을 촉매한다. 다른 유전자는 생리적으로 RA6의합성을 촉매하는 망사형 탈수소 효소 2 (RALDH2)를 인코딩하는 알데히드 탈수소 효소 1 가족 구성원 A2 (ALDH1a2)이다.
내장-호밍 Treg 세포 유도의 생체 내 확대는 IBD의 처리에 잠재적으로 중요하기 때문에, 다음 프로토콜에서 우리는 1α-하이드록실라제-RALDH2-과발현 DC(DC-CYP-ALDH 세포)의 생성을 위한 절차를 상세히 설명할 것이다. 생체 내에서 창자 호밍 Treg 세포의 향후 조사에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 DC-CYP-ALDH 세포의 사용을 설명, 말초 림프 조직에 창 자-homing Treg 세포의 유도를 증가 대 한. 우리의 데이터는 DC-CYP-ALDH 세포가 상응하는 기질(즉, 25[OH]D 및 레티놀,각각)의 존재 하에서 시험관내 에서 모두 1,25(OH)2D 및 RA의 국소 고농도 드노보를 합성할 수 있음을 보여주었다. 25(OH)D및 레티놀의 충분한 혈중 농도는 결핍이 있는 환자에서 각각 비타민 D와 A 보충제를 통해 쉽?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 수상 번호에 따라 동료 검토 의료 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실에 의해 지원되었다. W81XWH-15-1-0240 (XT). 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부의 승인을 받지는 않습니다. 이 작품은 또한 부분적으로 로마 린다 대학에서 의학부의 연구 혁신 보조금에 의해 지원되었다 (681207-2967 [XT와 GG], 681205-2967 [XT], 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
Riferimenti
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