In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.
Abstract
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa. Recentemente, mostramos que as células reguladoras t (Treg) são uma terapia promissora para a DII. Assim, este artigo apresenta um protocolo para o aumento in vivo da indução da pilha de Treg gut-homing. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo, vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e vitamina a-ida ativa (ácido retinóico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e AR com base em descobertas anteriores mostrando que 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeça de garfo P3 e interleucina-10) e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal nas células T. Para gerar tais células dendríticas projetadas, usamos um vetor lentiviral para transduzir células dendríticas para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase, que fisiologicamente catalisa a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 que codifica retinaldeído dehidrogenase 2, que fisiologicamente catalisa a síntese de AR. Este protocolo pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.
Introduction
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa1,2. Por esta razão, atualmente disponíveis E.U. Food and Drug Administration (FDA) medicamentos aprovados inibem as funções dos mediadores inflamatórios ou bloquear o homing de células imunes no intestino. No entanto, os mediadores inflamatórios e células imunes que são alvo também são necessários para defesas imunológicas. Como resultado, os inibidores do mediador inflamatório comprometem a defesa imunológica sistêmica e os bloqueadores de homing de células imunes enfraquecem a defesa imunológica do intestino, ambos os quais podem levar a graves conseqüências3,4. Além disso, os bloqueadores de homing de células imunes também podem bloquear o homing de células reguladoras T (Treg) no intestino e, portanto, pode piorar a tolerância imune do intestino já comprometida em pacientes com DII. Além disso, o bloqueio de células Treg homing no intestino também pode levar à supressão imunológica sistêmica devido ao acúmulo de células Treg no sangue5. Finalmente, inibidores e bloqueadores funcionam de forma transitória e, assim, exigem administrações frequentes. A administração freqüente desses inibidores e bloqueadores pode exacerbar ainda mais os efeitos colaterais desagradáveis.
Recentemente, propusemos uma nova estratégia que pode potencialmente mitigar ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais associados com medicamentos atuais para o tratamento de DII6. Esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing em tecidos linfóides periféricos6. A lógica desta estratégia é que as células Treg gut-homing especificamente lar do intestino e, portanto, não irá comprometer as defesas imunológicas sistêmicas. Além disso, uma vez que as células Treg podem potencialmente formar memória7,8,células Treg gut-homing pode potencialmente fornecer um controle estável da inflamação crônica do intestino em pacientes com DII e, assim, o tratamento não deve precisar ser administrado com tanta freqüência. Além disso, uma vez que esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing in vivo, não tem a preocupação de instabilidade in vivo em um ambiente altamente pró-inflamatório que está associado com a transferência adotiva de células Treg geradas in vitro9,10. A este respeito, as células Treg in vitro geradas são uma das estratégias propostas para o tratamento de doenças autoimunes11,12,13 e rejeição de transplante14,15. Finalmente, nesta estratégia, as células dendríticas (DCs) são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo: vitamina D ativa (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) e vitamina ativa A (ácido retinoico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e RA porque 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeceira P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal em células T18. Porque ambos 1,25 (OH)2D e RA também podem tolerizar DCs28,29, razão que os DCs projetados serão mantidos de forma evigorada em um status tolerogênico in vivo e,portanto,contornar as preocupações de instabilidade in vivo que estão associados com DCs tolerogenic in vitro gerados (TolDCs)19,20,21. A este respeito, toldcs também são uma das estratégias propostas para in vivo aumento das funções celulares Treg19,20,21. Para apoiar o nosso raciocínio, mostramos que os DCs projetados, após a entrega in vivo, podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos6.
Uma vantagem adicional de nossa estratégia proposta é que 1,25 (OH)2D também tem outras funções que podem beneficiar potencialmente pacientes com DII. Essas outras funções incluem a capacidade de 1,25 (OH)2D para estimular a secreção de antimicrobianos22 e suprimir a carcinogênese23. Infecções e cânceres são freqüentemente associados à DII24,25.
Para gerar os DCs que podem produzir concentrações localmente altas de 1,25 (OH)2D e RA de novo, usamos um vetor lentiviral para projetar DCs para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase (1α-hidroxilase), que catalisa fisiologicamente a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 (ALDH1a2) que codifica retinaldeído dehidrogenase 2 (RALDH2), que fisiologicamente catalisa a síntese de RA6.
Como o aumento in vivo da inin vivo de indução de células Treg de homing intestinal é potencialmente importante no tratamento da DII, no seguinte protocolo, detalharemos os procedimentos para a geração das DCs de 1α-hidroxilase-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo descrevemos o uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos. Nossos dados mostraram que as células DC-CYP-ALDH podem sintetizar concentrações localmente altas de novo de 1,25 (OH)2D e AR in vitro na presença de substratos correspondentes (ou seja, 25[OH]D e retinol, respectivamente). Porque concentrações sanguíneas suficientes de 25 (OH) D e retinol podem ser facilmente alcançadas através de suplementaçõe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Peer Reviewed Medical Research Program no âmbito do Prêmio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este trabalho também foi parcialmente apoiado por Bolsas de Inovação em Pesquisa do Departamento de Medicina da Universidade de Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT], e 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
Riferimenti
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