माइक्रोबियल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए नियंत्रित, गतिशील रासायनिक परिदृश्य पैदा करना
Summary
माइक्रोफ्लूइडिक और मिलीफ्लूइडिक सेटअप के भीतर फोटोलिसिस द्वारा गतिशील रासायनिक परिदृश्य की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। यह पद्धति विविध जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जिसमें एकल कोशिका और जनसंख्या स्तर दोनों पर गतिशील व्यवहार, पोषक तत्व तेज या सूक्ष्मजीवों के रसायनों के अनुकूलन शामिल हैं।
Abstract
हम नियंत्रित, गतिशील रासायनिक दालों की पीढ़ी के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं- जहां स्थानीयकृत रसायनीय माइक्रोस्केल पर अचानक उपलब्ध हो जाता है- माइक्रोबियल कीमोटैक्सिस प्रयोगों के लिए सूक्ष्म वातावरण बनाने के लिए। रासायनिक दालों को बनाने के लिए, हमने बैक्टीरियल निलंबन वाले पॉलीडिमिथाइलसिलिऑक्सेन (पीडीएम) माइक्रोफ्लूइडिक कक्ष के भीतर बंदी अमीनो एसिड के फोटोलिसिस द्वारा अमीनो एसिड स्रोतों को तुरंत शुरू करने के लिए एक प्रणाली विकसित की। हमने इस विधि को कीमोटैक्टिक जीवाणु, विब्रियो ऑर्डलीमें लागू किया, जो वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्रैक किए जाने के दौरान सक्रिय रूप से इन गतिशील रासायनिक ढाल पर चढ़ सकता है। एक फोटोमूवेबल प्रोटेक्टिव प्रोटेक्टिव ग्रुप के साथ रासायनिक संशोधन द्वारा जैविक रूप से निष्क्रिय (‘बंदी’) प्रदान किए गए अमीनो एसिड, निलंबन में समान रूप से मौजूद हैं, लेकिन उनकी अचानक रिहाई तक खपत के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जो उपयोगकर्ता-परिभाषित बिंदुओं पर समय और अंतरिक्ष में एक लगभग यूवी-ए केंद्रित एलईडी बीम के माध्यम से होता है। नाड़ी में जारी अणुओं की संख्या एक्सपोजर समय और अनकैगिंग अंश के बीच एक अंशांकन संबंध द्वारा निर्धारित की जा सकती है, जहां फोटोलिसिस के बाद अवशोषण स्पेक्ट्रम यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके विशेषता है। एक नैनोपोरस पॉलीकार्बोनेट (पीसीटीई) झिल्ली को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में एकीकृत किया जा सकता है ताकि अनकैगड यौगिकों और खर्च किए गए मीडिया के प्रवाह से निरंतर हटाने की अनुमति दी जा सके। पीसीटीई झिल्ली और पीडीएम माइक्रोफ्लूइडिक संरचना के बीच एक मजबूत, अपरिवर्तनीय बंधन झिल्ली को 3-अमीनोप्रोपाइथोक्सीलेन (एपीटीईएस) के समाधान के साथ कोटिंग करके हासिल किया जाता है जिसके बाद सतहों के प्लाज्मा सक्रियण को बंधुआ किया जाता है। एक कंप्यूटर-नियंत्रित प्रणाली विभिन्न स्थानों पर और विभिन्न तीव्रताओं के साथ दालों के उपयोगकर्ता-परिभाषित दृश्यों को उत्पन्न कर सकती है, ताकि निर्धारित स्थानिक और लौकिक परिवर्तनशीलता के साथ संसाधन परिदृश्य बनाया जा सके। प्रत्येक रासायनिक परिदृश्य में, व्यक्तिगत पैमाने पर बैक्टीरियल आंदोलन की गतिशीलता और जनसंख्या स्तर पर उनके संचय प्राप्त किए जा सकते हैं, जिससे कीमोटैक्टिक प्रदर्शन की मात्रा और पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक वातावरण में बैक्टीरियल एकत्रीकरण पर इसके प्रभाव की अनुमति दी जा सकती है।
Introduction
रोगाणु रसायन परिदृश्य को नेविगेट करने, पोषक तत्वों के स्रोतों और मेजबानों से संपर्क करने और हानिकारक पदार्थों से बचने के लिए, रासायनिक ढाल का पता लगाने और प्रतिक्रिया1में गतिशीलता को संशोधित करने की प्रक्रिया की कीमोटैक्सिस पर भरोसा करते हैं। ये माइक्रोस्केल प्रक्रियाएं रोगाणुओं और उनके पर्यावरण2,3के बीच बातचीत के मैक्रोस्केल काइनेटिक्स का निर्धारण करती हैं । सॉफ्ट लिथोग्राफी4सहित माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने नियंत्रित सूक्ष्म वातावरण बनाने की हमारी क्षमता में क्रांतिकारी बदलाव किया है जिसमें रोगाणुओं की बातचीत का अध्ययन करना है। उदाहरण के लिए, पिछले प्रयोगों ने उच्च पोषक तत्व ों की सांद्रता5,6के लिए मध्यवर्ती के अत्यधिक नियंत्रित, स्थिर ढाल पैदा करके बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का अध्ययन किया है। हालांकि, प्राकृतिक वातावरण में, माइक्रोस्केल रासायनिक ढाल अल्पकालिक हो सकता है-आणविक प्रसार से नष्ट-और पृष्ठभूमि की स्थिति अक्सर अत्यधिक पतला7हैं । माइक्रोबियल आबादी की कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया को सीधे मापने के लिए पहले अस्थिर रासायनिक वातावरण के संपर्क में आने के लिए, हमने तैयार किया और यहां माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक को फोटोलिसिस के साथ संयोजित करने के तरीकों का वर्णन किया, जिससे जंगली बैक्टीरिया प्रकृति में सामना करने वाले ढाल की नकल करते हैं।
अनकैगिंग तकनीक प्रकाश संवेदनशील जांच को नियोजित करती है जो कार्यात्मक रूप से एक निष्क्रिय रूप में जैव अणुओं को समाहित करती है। विकिरण बंदी अणु विज्ञप्ति, एक जैविक प्रक्रिया8के लक्षित क्षोभ की अनुमति । सेलुलर रसायन विज्ञान के तेजी से और सटीक नियंत्रण के कारण, जो कि अनकैगिंग9,बंदी यौगिकों के फोटोलासिस को पारंपरिक रूप से जीव विज्ञानियों, फिजियोलॉजिस्ट और न्यूरोसाइंटिस्टों द्वारा जीन10,आयनचैनल11और न्यूरॉन्स12की सक्रियता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हाल ही में, वैज्ञानिकों ने फोटोलिसिस के महत्वपूर्ण फायदों का लाभ उठाया है, जो कीमोटैक्सिस13का अध्ययन करने के लिए, व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं की फ्लैगेला स्विचिंग गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए एक स्टेपवाइज कीमोआकर्षितेंट उत्तेजना14,15के संपर्क में है, और त्रि-आयामी (3 डी) ग्रेडिएंट्स16में एकल शुक्राणु कोशिकाओं के गतिशील पैटर्न की जांच करने के लिए ।
हमारे दृष्टिकोण में, हम रासायनिक दालों को नियंत्रित करने के लिए बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों के भीतर बंदी अमीनो एसिड के फोटोलिसिस को लागू करते हैं, जो फोटोरिलीज के माध्यम से लगभग तुरंत उपलब्ध हो जाते हैं। एक कम आवर्धन (4x) उद्देश्य (एनए = 0.13, लगभग 40 माइक्रोन की गहराई) का उपयोग देखने के एक बड़े क्षेत्र (3.2 मिमी x 3.2 मिमी) पर हजारों बैक्टीरिया की जनसंख्या स्तर की एकत्रित प्रतिक्रिया के अवलोकन और एकल-कोशिका स्तर पर गति की माप दोनों की अनुमति देता है। हम इस विधि के दो अनुप्रयोग प्रस्तुत करते हैं: 1) एक ही रासायनिक नाड़ी की रिहाई के लिए जीवाणु संचय −अपव्यय गतिशीलता एक समान परिस्थितियों से शुरू का अध्ययन करने के लिए, और 2i)समय के तहत जीवाणु संचय गतिशीलता की विशेषता के लिए कई दालों की रिहाई अलग, स्थानिक विषम रसायनकी स्थिति । इस विधि का परीक्षण अमीनो एसिड ग्लूटामेट17की ओर कीमोटैक्सिस का प्रदर्शन करने वाले समुद्री बैक्टीरिया विब्रियो ऑर्डली पर किया गया है, लेकिन यह विधि मोटे तौर पर प्रजातियों और कीमोप्रोफेंट के विभिन्न संयोजनों के साथ-साथ कीमोटैक्सिस (जैसे, पोषक तत्व तेज, एंटीबायोटिक एक्सपोजर, कोरम सेंसिंग) से परे जैविक प्रक्रियाओं पर लागू होती है। यह दृष्टिकोण यथार्थवादी वातावरण में सूक्ष्मजीवों की पारिस्थितिकी और व्यवहार को स्पष्ट करने और अल्पकालिक गतिशील ढाल को नेविगेट करते समय व्यक्तिगत बैक्टीरिया का सामना करने वाले छिपे हुए व्यापार-नापसंद को उजागर करने में मदद करने का वादा करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि शोधकर्ताओं को नियंत्रित, सूक्ष्म और मिलीफ्लूइडिक उपकरणों में गतिशील ढाल के तहत बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने की अनुमति देती है, जिससे प्रजनन योग्य डेटा अधिग्रहण सक्षम होता है। फोटोल?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ईटीएच ज्यूरिख में पहली माइक्रोफैब्रिकेशन सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद डिस्कवरी अर्ली कैरियर शोधकर्ता पुरस्कार DE180100911 (D.R.B.), एक गॉर्डन और बेटी मूर मरीन माइक्रोबियल पहल अन्वेषक पुरस्कार GBMF3783 (आर.एस.) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 1-002745-000 (आरएस के लिए) ।
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
Riferimenti
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