Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek
Summary
Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.
Abstract
Kontrollü, dinamik kimyasal darbelerin üretimi için bir yöntem gösteriyoruz―lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale gelir―mikrobiyal kemotaksis deneyleri için mikro ortamlar oluşturmak için. Kimyasal darbeler oluşturmak için, bakteriyel süspansiyon içeren bir polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan odası içinde kafesli amino asitlerin fotolizi ile anında amino asit kaynaklarını yakın-anında tanıtmak için bir sistem geliştirdi. Bu yöntemi, video mikroskopi ile takip edilirken bu dinamik kimyasal degradelere aktif olarak tırmanabilen kemotaktik bakteri Vibrio ordalii’yeuyguladık. Fotoçıkarılabilir koruma grubu ile kimyasal modifikasyon ile biyolojik olarak inert (‘kafesli’) haline getirilen amino asitler, neredeyse UV-A odaklı LED ışını ile zaman ve mekanda kullanıcı tarafından tanımlanan noktalarda meydana gelen ani salınımına kadar süspansiyonda düzgün bir şekilde mevcut değildir, ancak tüketilemez. Darbede salınan molekül sayısı, fotoliz sonrası emilim spektrumunun UV-Vis spektroskopisi ile karakterize olduğu maruz kalma süresi ile uncaging fraksiyonu arasındaki kalibrasyon ilişkisi ile belirlenebilir. Bir nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membran kafeslenmemiş bileşikler ve harcanan ortam akışı ile sürekli kaldırma sağlamak için mikroakışkan cihaza entegre edilebilir. PCTE membranı ile PDMS mikroakışkan yapısı arasında güçlü, geri dönüşü olmayan bir bağ, membranın 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi ile kaplanması ve ardından bağlanacak yüzeylerin plazma aktivasyonu ile elde edilir. Bilgisayar kontrollü bir sistem, farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı bakliyat dizileri oluşturabilir, böylece öngörülen uzamsal ve zamansal değişkenlik ile kaynak manzaraları oluşturabilir. Her kimyasal ortamda, bireysel ölçekte bakteri hareketinin dinamiği ve popülasyon düzeyinde birikmesi elde edilebilir, böylece kemotaktik performans ve ekolojik olarak ilgili ortamlarda bakteriyel toplamalar üzerindeki etkilerinin ölçülmesi izin.
Introduction
Mikroplar chemotaxis güveniyor, kimyasal degradeler tespit ve yanıt motilite değiştirme süreci1, kimyasal manzara gezinmek için, besin kaynakları ve konakları yaklaşım, ve zararlı maddeler kaçmak. Bu mikroölçekli süreçler mikroplar ve çevreleri arasındaki etkileşimlerin makroölçekli kinetik belirlemek2,3. Mikroakışkanlar ve mikrofabrikasyon teknolojilerinde son zamanlarda ki gelişmeler, yumuşak litografi4de dahil olmak üzere, mikropların etkileşimlerini incelemek için kontrollü mikroortamlar yaratma yeteneğimizi kökten leştirmektedir. Örneğin, geçmiş deneyler yüksek besin konsantrasyonları için yüksek kontrollü, kararlı degradeler üreterek bakteriyel kemotaksis inceledik5,6. Ancak, doğal ortamlarda, mikro ölçekli kimyasal degradeler moleküler difüzyon tarafından kısa ömürlü―dağılmış―ve arka plan koşulları genellikle yüksek seyreltik7. Mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini doğrudan ölçmek için, mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirmek için yöntemler tasarladık ve burada tanımladık, böylelikle vahşi bakterilerin doğada karşılaştıkları degradeleri taklit ettik.
Uncaging teknolojisi, biyomolekülleri aktif olmayan bir biçimde işlevsel olarak kapsülleyen ışığa duyarlı problar kullanır. Işınlama kafesli molekülü serbest bırakır, biyolojik bir sürecin hedeflenen tedirginliği sağlar8. Hücresel kimyanın hızlı ve hassas kontrolü sayesinde 9,kafesli bileşiklerin fotolsisi geleneksel olarak biyologlar, fizyologlar ve nörologlar tarafından genlerin aktivasyonunu incelemek için kullanılmıştır10, iyon kanalları11, ve nöronlar12. Daha yakın zamanda, bilim adamları kemotaksis13çalışma fotoliz önemli avantajları kaldıraçlı var , bir adım adım kemoattractant uyarıcı maruz bireysel bakteri hücrelerinin flagella anahtarlama dinamiklerini belirlemek için14,15, ve üç boyutlu tek sperm hücrelerinin hareketlilik desenleri araştırmak için (3D) gradyanlar16.
Yaklaşımımızda, kafesli amino asitlerin fotolizisini mikroakışkan cihazlar içinde uygulayıp, bir bakteri popülasyonunun kontrollü kimyasal darbelere karşı davranışsal tepkisini incelemek için, fotosalınım yoluyla neredeyse anında kullanılabilir hale gelir. Düşük büyütme (4x) hedefinin (NA = 0,13, odak derinliği yaklaşık 40 μm) kullanımı, hem binlerce bakterinin geniş bir görüş alanı (3,2 mm x 3,2 mm) üzerinde popülasyon düzeyindeki toplama tepkisini gözlemlemenizi hem de tek hücre düzeyinde hareket ölçümü sağlar. Bu yöntemin iki uygulamasını salıyoruz: 1) tek tip koşullardan başlayarak bakteri birikimi−dağılım dinamiklerini incelemek için tek bir kimyasal darbenin serbest bırakılması ve 2i) zaman değişen, mekansal heterojen kemoattractant koşullar altında bakteri birikimi dinamiklerini karakterize etmek için birden fazla darbenin serbest bırakılması. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan test edilmiştir17, ama yöntem geniş tür ve kemoattractants farklı kombinasyonları için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için (örneğin, besin alımı, antibiyotik maruzkalma, çoğunluk algılama). Bu yaklaşım, mikroorganizmaların gerçekçi ortamlardaki ekoloji ve davranışlarını niçin açıklığa kavuşturmayı ve geçici dinamik degradelerde gezinirken tek tek bakterilerin karşılaştıkları gizli dengeleri ortaya çıkarmayı vaat eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, araştırmacıların mikro ve miliakışkan cihazlarda kontrollü, dinamik degradeler altında bakteriyel kemotaksileri incelemelerine olanak sağlayarak tekrarlanabilir veri toplamayı mümkün kılmasını sağlar. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin yakın anında oluşturulması, örneğin, batan deniz parçacıkları25arkasında tüylerin diffüzive yayılması, ya da lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin sinyalleri bir dizi doğada karşılaşma b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ETH Zürih’te Ilk mikrofabrikasyon tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (D.R.B.), Gordon ve Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (R.S.) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bursu ile desteklenmiştir. 1-002745-000 (R.S.’ye).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
Riferimenti
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
