Descriviamo un protocollo di inoculazione ritardata per generare infezioni croniche delle ferite nei topi immunocompetenti.
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Articolo metodologico
Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un grave agente patogeno nosocomial e crescente rilevanza per la salute umana e le malattie, in particolare nell'impostazione di infezioni croniche delle ferite nei pazienti diabetici e ricoverati in ospedale. Vi è un'urgente necessità di modelli di infezione cronica per aiutare nello studio della patogenesi delle ferite e nello sviluppo di nuove terapie contro questo agente patogeno. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza l'inoculazione ritardata 24 ore dopo la ferita escissionale a tutto spessore. L'infezione della matrice provvisoria della ferita presente in questo momento previene la rapida staccazione o la diffusione dell'infezione e stabilisce invece un'infezione cronica della durata di 7-10 giorni senza la necessità di impiantare materiali estranei o di soppressione immunitaria. Questo protocollo imita un tipico decorso temporale di infezione post-operatoria negli esseri umani. L'uso di un ceppo luminescente di P. aeruginosa (PAO1:lux) consente una valutazione giornaliera quantitativa del carico batterico per le infezioni da ferite da P. aeruginosa. Questo nuovo modello può essere uno strumento utile nello studio della patogenesi batterica e nello sviluppo di nuove terapie per le infezioni croniche della ferita P. aeruginosa.
Introduzione
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un batterio a forma di asta Gram-negative con crescente rilevanza per la salute umana e la malattia. È responsabile di un'estesa morbilità e mortalità in contesti nosocomiali, in particolare per quanto riguarda le infezioni delle ferite nei pazienti immunocompromessi1,2. L'emergere di ceppi multifarmacoresistenti di questo agente patogeno ha fornito ulteriore impulso per l'indagine sui fattori che contribuiscono alla virulenza Di P. aeruginosa, i meccanismi della resistenza agli antibiotici P. aeruginosa e nuovi metodi per la prevenzi....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Preparazione e crescita dei batteri
- Condurre tutto il lavoro con P. aeruginosa e gli animali con precauzioni BSL-2 in base al comitato istituzionale per la biosicurezza del ricercatore e alle linee guida del comitato per l'uso degli animali. Eseguire tutti i passaggi qui descritti che coinvolgono P. aeruginosa, compresa l'inoculazione del topo, in un mobile di biosicurezza.
- Il ceppo luminescente PAO1:lux di P. aeruginosa è disponibile dal nostro laboratorio su....
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Risultati
Utilizzando un ceppo luminescente di PAO1 con un plasmide che codifica il luxABCDE reporter system (PAO1:lux), abbiamo eseguito la ferita eccisionale sui topi, inoculato queste ferite con planctonico P. aeruginosa 24 h più tardi, e onere batterico nel tempo(Figura 1 e Figura 2). Un'immagine rappresentativa ottenuta utilizzando un sistema ottico di imaging dimostra che questo modello produce luminescenza rilevabile (
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Discussione
Abbiamo sviluppato un nuovo modello di infezione della ferita P. aeruginosa ritardata. La strategia di ritardare l'inoculazione con i batteri fino a 24 h dopo il ferimento eccisionale consente la valutazione delle infezioni della ferita in un lasso di tempo di 1 settimana. Utilizzando un ceppo luminescente di P. aeruginosa, è possibile monitorare la progressione dell'infezione durante il corso di infezione. Il più lungo decorso dell'infezione rispetto ad altri modelli di infezione da P. aeruginosa
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.
Ringraziamenti
Il vettore di costruzione luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 è stato un dono gracile di J. Hardy. Gli schemi sono stati creati con BioRender.com. Ringraziamo il laboratorio di G. Gurtner per i loro consigli sul modello di infezione da ferita. Ringraziamo anche T. Doyle dello Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging per la sua esperienza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R21AI13370, R21AI13340, R01AI12492093, e le sovvenzioni di Stanford SPARK, il Falk Medical Research Trust e la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) a P.L.B. C.R.D è stata supportata da T32AI0007502. Una Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineerin....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 ago sterile | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 ago sterile | BD | 305127 | |
| Tampone imbevuto di alcol | BD | 326895 | |
| Software di imaging Aura | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorfina SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J topi maschi | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Punzone per biopsia monouso, 6mm | Integra | 33-36 | |
| Forbici fini - Carburo di tungsteno | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Sterilizzatore a secco per perle di vetro | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
| BioReagenti Agar Fisher granulato | BP9744 | ||
| Termoforo | Milliard | 804879481218 | |
| Siringa da insulina con ago da 28 G | BD | 329461 | |
| Lago X Sistema di imaging | Spectral Instruments Spectral Imaging | n/a | |
| LB brodo | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| Siringa Leur-Lok da 1 mL | BD | 309628 | |
| Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Lozione | 919152 | |
| Nair con olio per bambini | Church e Dwight | n/a | Disponibile in qualsiasi farmacia |
| Pinze ottagonali | Strumenti per la scienza | 11041-08 | |
| Piastra di Petri | Falcon | 351029 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Pellicola trasparente per pressare e sigillare | Glad | n/a | |
| Siringa per insulina SafetyGlide con ago da 30 G | Siringa per | 305934 | |
| Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| Bilancia | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Henry | Schein Animal Health | 29908 | |
| Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
Riferimenti
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic....
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Ristampe e permessi
