En fördröjd inokulering modell av kronisk pseudomonas aeruginosa Sår infektion

Summary

Vi beskriver ett försenat inokuleringsprotokoll för att generera kroniska sårinfektioner hos immunkompetenta möss.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är en stor nosokomial patogen av ökande relevans för människors hälsa och sjukdom, särskilt vid fastställandet av kroniska sårinfektioner hos diabetiker och sjukhuspatienter. Det finns ett akut behov av kroniska infektionsmodeller för att underlätta undersökningen av sårpatogenes och utvecklingen av nya terapier mot denna patogen. Här beskriver vi ett protokoll som använder fördröjd inokulering 24 timmar efter full-tjocklek excisional såra. Infektionen av den provisoriska sårmatrisen som för närvarande för närvarande försvårar antingen snabb röjning eller spridning av infektion och fastställer i stället kronisk infektion som varar 7–10 dagar utan behov av implantation av främmande material eller immunsuppression. Detta protokoll härmar en typisk temporal kurs av postoperativ infektion hos människor. Användningen av en luminescent P. aeruginosa stam (PAO1:lux) möjliggör kvantitativ daglig bedömning av bakteriell börda för P. aeruginosa sårinfektioner. Denna nya modell kan vara ett användbart verktyg vid undersökning av bakteriell patogenes och utvecklingen av nya terapier för kroniskA P. aeruginosa sårinfektioner.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är en Gram-negativ stavformad bakterie med ökande relevans för människors hälsa och sjukdom. Det är ansvarig för omfattande sjuklighet och dödlighet i nosocomial inställningar, särskilt med sårinfektioner hos immunkomprometterade patienter^1,2. Framväxten av multiresistenta stammar av denna patogen har gett ytterligare impulser till utredning av faktorer som bidrar till P. aeruginosa virulens, mekanismer för P. aeruginosa antibiotikaresistens, och nya metoder för förebyggande och behandling av denna dödliga infektion³. Som sådan har behovet av djurmodeller av kronisk sårinfektion som verktyg för att undersöka dessa forskningsfrågor aldrig varit större.

Tyvärr, många djur modeller av P. aeruginosa infektion tenderar att simulera akut infektion med snabb lösning av infektion eller snabb nedgång på grund av sepsis⁴,^5,som inte tillräckligt simulera ofta kronisk karaktär av dessa infektioner. För att ta itu med denna nackdel, vissa modeller använder implantation av främmande organ såsom agar pärlor, silikonimplantat, eller alginate geler^6,7,8. Andra modeller använder möss som är immunkomprometterade på grund av hög ålder, fetma eller diabetes, eller genom farmakologiska medel såsom cyclophosphamide-inducerad neutropeni^9,10,11,12. Emellertid, antingen användningen av främmande material eller immun komprometterade värdar sannolikt förändrar den lokala inflammatoriska processen, vilket gör det svårt att få en förståelse för patofysiologi inblandade i kroniska sårinfektioner i värdar med annars normala immunsystem.

Vi har utvecklat en kronisk modell av P. aeruginosa sårinfektion hos möss som innebär fördröjd inokulering med bakterier efter excisional såra. Fördröjd inokulering möjliggör experiment som bedömer bakteriebördan som sträcker sig ut till minst 7 dagar. Denna modell öppnar nya möjligheter för att undersöka både patogenes och nya behandlingar av P. aeruginosa kroniska infektioner.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stanford University. 1. Beredning och tillväxt av bakterier Utför allt arbete med P. aeruginosa och djur med BSL-2 försiktighetsåtgärder enligt forskarens institutionella riktlinjer för biosäkerhet och riktlinjer för djuranvändningskommittén. Gör alla steg som beskrivs här med P. aeruginosa, inklusive musinokulering, i ett biosäkerhetsskåp. <li…

Representative Results

Med hjälp av en luminescerande stam av PAO1 med en plasmid kodning luxABCDE reporter systemet (PAO1:lux), utförde vi excisional sårpå möss, inokulerade dessa sår med planktoniska P. aeruginosa 24 h senare, och mätt bakteriell börda över tiden(figur 1 och figur 2). En representativ bild som erhållits med hjälp av ett bildoptiskt system visar att denna modell resulterar i detekterbar luminans<strong class="xfig"…

Discussion

Vi har utvecklat en roman försenad inokulering P. aeruginosa sårinfektion modell. Strategin att fördröja inokulering med bakterier till sen 24 h efter excisional sår möjliggör utvärdering av sårinfektioner under en 1-veckors tidsram. Genom att använda en luminescerande stam av P. aeruginosa, är det möjligt att spåra infektionprogression under infektionskursen. Den längre infektionsförloppet jämfört med andra P. aeruginosa infektion modeller kommer att möjliggöra nya möjlighe…

Materials

0.9% Sodium Chloride injection	Hospira	2484457
18 G x 1 sterile needle	BD	305195
25 G x 1 1/5 sterile needle	BD	305127
Alcohol swab	BD	326895
Aura Imaging Software	Spectral Instruments Imaging	n/a
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
Buprenorphine SR LAB	Zoopharm	n/a
C57BL/6J male mice	The Jackson Laboratory	000664
Disposable biopsy punch, 6mm	Integra	33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer	Harvard Apparatus	61-0183
Granulated Agar	Fisher BioReagents	BP9744
Heating Pad	Milliard	804879481218
Insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
Lago X Imaging System	Spectral Instruments Imaging	n/a
LB broth	Fisher BioReagents	BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe	BD	309628
Mini Arco Animal Trimmer	Wahl Professional	919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil	Church and Dwight	n/a	Available at any pharmacy
Octagon Forceps	Fine Science Tools	11041-08
Petri dish	Falcon	351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap	Glad	n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle	BD	305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Scale	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplical Nutritional Supplement	Henry Schein Animal Health	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W