Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

Summary

Mikroskala termoforese oppnår bindende konstanter raskt til lav materialkostnad. Enten merket eller etikettfri mikroskala termoforese er kommersielt tilgjengelig; Etikettfri termoforese er imidlertid ikke i stand til mangfoldet av interaksjonsmålinger som kan utføres ved hjelp av fluorescerende etiketter. Vi tilbyr en protokoll for merkede termoforesemålinger.

Abstract

Evnen til å bestemme lipidenes bindende affinitet til proteiner er en viktig del av forståelsen av protein-lipid interaksjoner i membranhandel, signaltransduksjon og cytoskeletal ombygging. Klassiske verktøy for måling av slike interaksjoner inkluderer overflateplasmon resonans (SPR) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Mens kraftige verktøy, disse tilnærmingene har tilbakeslag. ITC krever store mengder renset protein samt lipider, noe som kan være kostbart og vanskelig å produsere. Videre er ITC så vel som SPR svært tidkrevende, noe som kan legge betydelig til kostnadene ved å utføre disse eksperimentene. En måte å omgå disse begrensningene på er å bruke den relativt nye teknikken for mikroskala termoforese (MST). MST er rask og kostnadseffektiv ved hjelp av små mengder prøve for å oppnå en metningskurve for en gitt bindingshendelse. Det finnes for øyeblikket to typer MST-systemer tilgjengelig. En type MST krever merking med fluorofor i det blå eller røde spekteret. Det andre systemet er avhengig av den iboende fluorescensen av aromatiske aminosyrer i UV-serien. Begge systemene oppdager bevegelsen av molekyler som svar på lokalisert induksjon av varme fra en infrarød laser. Hver tilnærming har sine fordeler og ulemper. Etikettfri MST kan bruke ukodede innfødte proteiner; Imidlertid er mange analytter, inkludert legemidler, fluoresce i UV-området, noe som kan forstyrre bestemmelsen av nøyaktige _KD-verdier. Til sammenligning gir merket MST mulighet for et større mangfold av målbare parvise interaksjoner ved hjelp av fluorescerende merkede sonder festet til ligander med målbare absorbanser i det synlige området i motsetning til UV, noe som begrenser potensialet for å forstyrre signaler fra analytter.

Introduction

Mikroskala termoforese er en relativt ny teknikk for å bestemme disassosiasjonskonstanter (KD) samt hemmingskonstanter (_IC50) mellom biokjemisk relevante ligander. Den ledende kommersielle forhandleren for MST (f.eks. NanoTemper) tilbyr to populære MST-teknologier: 1) Label free MST som krever en fluorescerende tag, og 2) merket termoforese ved hjelp av den iboende fluorescensen av proteiner avhengig av antall aromatiske rester som finnes i hvert ^protein1. En ulempe med etikettfri termoforese er at det i de fleste tilfeller ikke tillater måling av proteinproteininteraksjoner. Det kan imidlertid være mulig å konstruere proteiner uten aromatiske aminosyrer som tryptofan for bruk i etikettfri termoforese2.

MST måler bevegelsen av partikler som svar på induksjon av mikroskopiske temperaturfelt initiert av en infrarød laser i tilgjengelige ^teknologier1. MST kan brukes til å måle proteinproteininteraksjoner, protein-lipidinteraksjoner, protein-små molekyler, konkurranseeksperimenter og til og med interaksjoner mellom små molekyler så lenge man kan produsere nok signalseparasjon. I tillegg tillater MST måling av membranproteinbaserte interaksjoner innebygd i enten liposomer eller nanodiscs. Merket termoforese utnytter bruken av fluorescerende merkede tagger som muliggjør kjemisk kontrollerbar separasjon av signal mellom ligand og analytt. KD-verdier kan oppnås ved hjelp av termoforese for interaksjoner som involverer proteinbinding ved lave nanomolarkonsentrasjoner, som i de fleste tilfeller er en mye lavere konsentrasjon av protein enn det som kreves for isotermisk kalorimetri (ITC)³. I tillegg har MST ikke strenge bufferkrav som kreves for overflateplasmonresonans (SPR)⁴ og merket termoforese kan til og med brukes til å måle bindende konstanter av proteiner av interesse fra ikke-fullstendig rensede ^{proteinløsninger5} med genetisk innsatte fluorescerende ^koder6. En ulempe med MST er at kinetiske parametere ikke kan oppnås lett for MST som i ^SPR2.

Termoforesemålinger avhenger av den lokale temperaturforskjellen til en løsning. Denne varmen kan genereres fra en infrarød laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor koblet til en infrarød (IR) stråle og kan plukke opp endringer i fluorescens fra lokale konsentrasjonsendringer av fluorescerende molekyler på det punktet hvor IR-laseren er målrettet. MST-enheten bruker en IR-målrettet laser koblet direkte til en fluorescensdetektor fokusert på samme tidspunkt som varmen genereres i løsningen. Dette muliggjør robust deteksjon av temperaturendringer som tilsvarer uttømming av molekyler ved varmepunktet generert av IR-laseren. Målt fluorescens reduseres vanligvis nærmere IR-laseren som følge av temperaturøkninger. Forskjellene målt som et resultat kan skyldes flere faktorer, inkludert ladning, størrelse eller solvasjon entropi. Disse forskjellene måles som endringer i fluorescens som følge av induksjon av varme eller bevegelse av molekyler fra varme til kaldere deler av kapillæren.

Når du laster en kapillær med en gitt løsning, er det viktig å forlate luft i hver ende av kapillæren og ikke laste kapillæren helt full. Den kommersielle kapillæren har ca 10 μL løsning. Man kan oppnå nøyaktige målinger med 5 μL løsning så lenge løsningen er manipulert til midten av kapillæren, det er ingen luftbobler (potensielt degas før lasting av kapillær), og man er forsiktig med å laste stativet for ikke å jostle løsningen fra midten av kapillæren, hvor den infrarøde laseren er målrettet. Hvis laseren ikke kommer i kontakt fullt ut med løsningen, vil resultatet mest sannsynlig være en av tre ubrukelige utganger for den konsentrasjonen: 1) ingen eller lav fluorescensdeteksjon, 2) høyere fluorescensdeteksjon (potensielt med hakket topp), eller 3) fluorescensdeteksjon innenfor andre verdier fra gitt titrering, men med en hakket og uberørt topp.

For merket termoforese er det optimalt å ha et fluorescenssignal over 200 og under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten bruker en rekke LED-intensiteter fra 0 til 100, som kan velges for å oppnå et signal over 200 eller under 2000. Alternativt kan man bruke forskjellige konsentrasjoner av den merkede liganden for å endre fluorescenssignalet til et optimalt nivå. Det er viktig å kjøre en cap scan med en gitt MST-måling som referanse når du analyserer data, da en dårlig cap scan ofte kan resultere i et punkt som senere kan bestemmes å være en outlier. Hver kjøring bør ta omtrent 30 minutter hvis du måler en enkelt MST-strøm med en hetteskanning. De kommersielle enhetene tillater endringer i MST-strøm. I eldre programvareversjoner kan dette angis fra 0 til 100. og i senere versjoner kan man velge lav, middels eller høy MST. For å oppnå robuste spor, kan det hende at en forsker må prøve hver av disse og bestemme hvilken MST-innstilling som resulterer i de mest robuste dataene for en gitt interaksjon.

Protocol

1. Fremstilling av materialer Forbered fosfatbufret saltvann (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 og 2 mM KH2PO4, pH 7,41. Forbered NTA-Atto 647 N fargestoff. Fortynn lager NTA-Atto 647 N fargestoff til 100 nM fra en 100% DMSO-løsning til PBS uten Tween. Express Vam7-His8 – Protein som fusjonsprotein i E. coli og rense ved hjelp av Ni-NTA og størrelseseksklusjonskromatografi8.</l…

Representative Results

Dette er et eksempel på utdata som bruker affinitetsanalysen. Den merkede MST ble brukt til å bestemme bindingskonstanten til Vam7-His8 til den løselige dioktanoyl (DiC8) PA av et av sine naturlige substrater9. Figur 1 presenterer de termoforetiske sporene fra en studie av en 1:1-titrering av DiC8 PA fra 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Innledende fluorescens (tid før infrarød laser slått på), Tjump (tid først etter at infrarød laser slått på) og termoforese (n…

Discussion

Bestemmelsen av Vam7-His8binding til DiC8-PA ga en robust montert KD for den gitte interaksjonen, som er litt lavere affinitet enn den målte KD av Vam7-His8 til PA liposomer (upublisert). Denne forskjellen skyldes mest sannsynlig mangel på en membran, noe som generelt resulterer i lavere affinitet for membranspesifikke lipidbindingsinteraksjoner og viser derfor rollen for liposomets membranstillas til denne ^{interaksjonen11}.

<p class="…

Materials

Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments