Method Article

Combinazione di microdissezione laser di cattura e qPCR microfluidico per analizzare i profili trascrizionali di singole cellule: un approccio di biologia dei sistemi alla dipendenza da oppioidi

DOI:

10.3791/60612

⸱

March 8th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La profonda eterogeneità trascrizionale nelle singole cellule anatomicamente adiacenti suggerisce che la robusta funzionalità dei tessuti può essere ottenuta dalla diversità del fenotipo cellulare. Gli esperimenti a una cellula che studiano le dinamiche di rete dei sistemi biologici dimostrano risposte cellulari e tissutali a varie condizioni a risoluzione biologicamente significativa. Qui, spieghiamo i nostri metodi per raccogliere singole cellule da luoghi anatomicamente specifici e misurare accuratamente un sottoinsieme dei loro profili di espressione genica. Uniamo la microdisezione di cattura laser (LCM) con le reazioni della catena quantitativa di trascrizione inversa microfluidica (RT-qPCR). Usiamo anche questa piattaforma microfluidica RT-qPCR per misurare l'abbondanza microbica del contenuto intestinale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La misurazione dei profili di espressione genica di singole cellule ha dimostrato un'ampia eterogeneità fenotipica all'interno di un tessuto. Questa complessità ha complicato la nostra comprensione delle reti biologiche che governano la funzione dei tessuti. Il nostro gruppo e altri hanno esplorato questo fenomeno in molti tessuti e condizioni1,2,3,4,5,6. Questi esperimenti non solo suggeriscono che la regolazione delle reti di espressione genica è alla base di tale eterog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni di Animal Care and Use Committee (IACUC) di Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine IACUC.

1. Modello animale

  1. Inserire due pellet di solfato di morfina a lento rilascio 75 mg o due pellet placebo sottocutanei in ratti Maschi Maschi Adulti Sprague-Dawley.
    1. Utilizzare un abito e guanti in modo appropriato per la chirurgia sterile minore. Se necessario, rasare il dorsum del ratto con i tagliacapelli.
    2. Applicare l'ungu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La selezione delle singole cellule è stata convalidata sia visivamente che molecolarmente. Visivamente, la morfologia cellulare è stata vista prima della raccolta delle cellule. Le cellule raccolte sono state poi viste alla stazione QC e la macchia dei nuclei cellulari (DAPI) si sovrapponeva alla fluorescenza del marcatore di selezione cellulare. Figura 2A mostra le immagini rappresentative di una diapositiva con prosencefalo del ratto emisec.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biologia a cellula singola ha dimostrato l'eterogeneità dei fenotipi cellulari e la robustezza della funzione tissutale. Questi risultati hanno fornito informazioni sull'organizzazione dei sistemi biologici sia su macro che su microscala. In questo caso, descriviamo la combinazione di due metodi, LCM e qPCR microfluidico, per ottenere misure di trascrittoma a cella singola che forniscono specificità anatomica e precisione trascrizionale a un costo relativamente basso (Figura 1). Il nostro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro qui presentato è stato finanziato tramite NIH HLB UL1 33360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS ed EVB, e T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO'S.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Caricamento ReagenteFluidigm85000802-RNA
48.48 Dynamic Array IFC perGene Expression FluidigmBMK-M-48.48NA
96.96 Dynamic Array IFC per Gene ExpressionFluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-CD11Β AnticorpoGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN, clone A60EMD MilliporeMAB377Colorazione neuronale
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNA
NA Biomark HDFluidigmNART-qPCR Piattaforma
Siero BovinoSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific 11753500Componenti della soluzione tampone di lisi
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Dispositivo di estrazione del campioneThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost PlusThermoFisher Scientific22-037-246Vetrini in vetro semplice
GeneAmp Provetta di reazione a parete sottile ThermoFisherScientificN8010611
GFAP Anticorpo monoclonaleThermoFisher ScientificA-21294Colorazione di astrociti
Capra anti-Topo IgG (H+L), Superclonale&commercio; Anticorpo secondario ricombinante, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNA
NA RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix con Low RoxBio-RadPN 172-5211Rox master mix
Kit di sintesi cDNA SuperScript VILOThermoFisher Scientific11754250contiene VILO e la proteina SuperScript
T4 Gene 32New Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionMicrofluidic qPCRSingle Cell AnalysisTranscriptional ProfilingCentral Nucleus AmygdalaOpioid DependenceGene ExpressionMicrofluidic RT PCRCell IsolationTissue Sectioning

Related Articles