Сочетание лазерного захвата микродиссекции и микрофлюидных qPCR для анализа транскрипционных профилей отдельных клеток: Системная биология Подход к опиоидной зависимости
Summary
Этот протокол объясняет, как собирать одиночные нейроны, микроглии и астроциты из центрального ядра миндалины с высокой точностью и анатомической специфичностью с помощью микрорассечения лазерного захвата. Кроме того, мы объясняем наше использование микрофлюидных RT-qPCR для измерения подмноза транскриптома этих клеток.
Abstract
Глубокая транскрипционная неоднородность в анатомически смежных одиночных клетках позволяет предположить, что надежная функциональность тканей может быть достигнута за счет разнообразия клеточного фенотипа. Одноклеточные эксперименты, исследующие сетевую динамику биологических систем, демонстрируют клеточные и тканевые реакции на различные состояния при биологическом разрешении. В этом мы объясняем наши методы сбора одиночных клеток из анатомически конкретных мест и точного измерения подмножества их профилей экспрессии генов. Мы комбинируем микродиссекцию захвата лазера (LCM) с микрофлюидной обратной транскрипцией количественных полимеразных цепных реакций (RT-qPCR). Мы также используем эту микрофлюидную платформу RT-qPCR для измерения микробного изобилия содержимого кишечника.
Introduction
Измерение профилей экспрессии генов отдельных клеток продемонстрировало обширную фенотипическую неоднородность в ткани. Эта сложность осложнила наше понимание биологических сетей, которые регулируют функцию тканей. Наша группа и другие исследовали это явление во многих тканях и условиях1,2,3,4,5,6. Эти эксперименты не только показывают, что регулирование сетей экспрессии генов лежат в основе такой неоднородности, но и то, что одноклеточное разрешение показывает сложность функции тканей, которую не оценить разрешение на уровне тканей. Действительно, лишь небольшое меньшинство клеток может реагировать на конкретные условия или вызов, но влияние этих клеток на общую физиологию может быть существенным. Кроме того, подход системной биологии, который применяет многовариантные методы к высокомерным наборам данных из нескольких типов клеток и тканей, может выяснить общесистемные эффекты лечения.
Мы объединяем LCM и микрофлюидные RT-qPCR для получения таких наборов данных. Мы используем этот подход здесь в отличие от сбора одиночных клеток с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) и с помощью РНК секвенирования (РНК-сек) для измерения их транскриптома. Преимущество LCM перед FACS является то, что точная анатомическая специфика одиночных клеток может быть документально с LCM, относительно и абсолютно. Кроме того, в то время как РНК-сек может измерять больше функций, которые RT-qPCR, микрофлюидные RT-qPCR дешевле и имеет более высокую чувствительность и специфичность7.
В этом репрезентативном эксперименте, мы исследовали влияние опиоидной зависимости и налтрексон-поспешный опиоидный вывод на крыснейронных, микроглии и экспрессии генов астроцитов в центральном ядре миндалины (CeA) и кишечной микрофлоры изобилие4. Были проанализированы четыре группы лечения: 1) Плацебо, 2) Морфин, 3) Налтрексон, и 4) Вывод(рисунок 1). Мы обнаружили, что опиоидная зависимость существенно не изменила экспрессию генов, но этот опиоидный вывод индуцировал экспрессию воспалительных генов, в частности Tnf. Астроциты были наиболее пострадавших типа клеток. Микрофлора кишечника была глубоко пострадавших от опиоидных вывода, как указано на снижение в Firmicutes к Bacteroides отношение, которое является установленным маркером дисбактериоз кишечника8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноклеточная биология продемонстрировала неоднородность клеточных фенотипов и надежность функции тканей. Эти выводы позволили получить представление об организации биологических систем как в макро-, так и на микроуровне. Здесь мы описываем сочетание двух методов, LCM и микрофлюидных…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, представленная здесь, финансировалась через NIH HLB U01 HL1HL1 HL133360, присужденную JS и RV, NIDA R21 DA036372, присужденную JS и EVB, и T32 AA-007463, присужденную Яну Хуку в поддержку SJO’S.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Riferimenti
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
