Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.
Los modelos in vivo del cáncer de páncreas proporcionan herramientas invaluables para estudiar la dinámica de enfermedades, la infiltración inmune y nuevas estrategias terapéuticas. El modelo de murina ortotópica se puede realizar en grandes cohortes de ratones inmunocompetentes simultáneamente, es relativamente barato y preserva el microambiente del tejido cognado. La cuantificación de la infiltración de células T y la actividad citotóxica dentro de los tumores ortotópicos proporciona un indicador útil de una respuesta antitumoral.
Este protocolo describe la metodología para la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos mediante inyección de un bajo número de células tumorales sinémicas resuspendidas en una membrana de sótano de 5 l directamente en el páncreas. Los ratones que llevan tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en alcanzar la variable, momento en el que los tumores se pueden cosechar y procesar para caracterizar la actividad de células T infiltrantes en el tumor. La digestión enzimática rápida mediante colagenasa y DNase permite extraer una suspensión de una sola célula de los tumores. Se conservan los marcadores de viabilidad y superficie celular de las células inmunitarias extraídas del tumor; por lo tanto, es apropiado para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo la clasificación celular asistida por flujo de células inmunitarias para el cultivo o la extracción de ARN, el análisis de citometría de flujo de las poblaciones de células inmunitarias. Aquí, describimos la estimulación ex vivo de las poblaciones de células T para la cuantificación de citoquinas intracelulares (IFN y TNF) y la actividad de degranulación (CD107a) como una medida de la citotoxicidad general. Los digeridos de tumor entero fueron estimulados con acetato de miristate de phorbol y yonomicina durante 5 h, en presencia de anticuerpos anti-CD107a con el fin de regular la producción de citoquinas y la desgranulación. La adición de brefeldina A y monensina para las 4 h finales se realizó para bloquear el transporte extracelular y maximizar la detección de citoquinas. Luego se realizó la tinción extra e intracelular de células para el análisis de citometría de flujo, donde se cuantificó la proporción de células IFN+, TNF+ y CD107a+ CD4+ y CD8+ T.
Este método proporciona una base de partida para realizar un análisis exhaustivo del microambiente tumoral.
Este método detalla, de principio a fin, el procedimiento quirúrgico para generar tumores pancreáticos ortotópicos utilizando una cantidad mínima de material celular y la posterior disociación rápida de tumores establecidos para el análisis integral de la citometría de flujo de las poblaciones de células inmunitarias, incluyendo el análisis ex vivo de la función de células T.
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un carcinoma agresivo con sólo el 8 % de los pacientes que sobreviven a 5 años1. Dado que menos del 20 % de los pacientes son elegibles para la resección quirúrgica2,las muestras de pacientes frescos no son fácilmente accesibles para la investigación y, por lo tanto, los modelos in vivo proporcionan herramientas esenciales para investigar esta enfermedad. Existen múltiples modelos murinos de PDAC: ortotópicos, subcutáneos, transgénicos, intravenosos y derivados del paciente (PDX), ampliamente descritos aquí3. El modelo ortotópico descrito aquí permite la inyección de células PDAC singénicas en el páncreas de ratones inmunocompetentes. Esto se puede realizar en grandes cohortes de ratones de tipo salvaje o mutante, y por lo tanto proporciona un modelo rentable y consistente para la comparación de agentes terapéuticos. Es importante destacar que el modelo ortotópico proporciona el microambiente cognado para el crecimiento de células tumorales y metástasis en nuestras manos y otros4 a sitios clínicamente relevantes (por ejemplo, hígado), haciéndolo más relevante clínicamente que los modelos subcutáneos o inducidos químicamente. Los tumores ortotópicos muestran características clave de PDAC, como una fuerte reacción desmoplástica con una abundancia de fibroblastos y la deposición de matriz extracelular5. Los modelos transgénicos de PDAC son el estándar de oro del modelo murino y el más utilizado es el modelo KPC, que expresa el mutante KrasG12D/+ y Trp53R172H/+ bajo el promotor Pdx-1-Cre 6 específico del páncreas. Los modelos adicionales de KPC y otros modelos de In vivo PDAC se revisan aquí7. Los ratones KPC desarrollan espontáneamente tumores pancreáticos con una progresión de la enfermedad que replica fielmente las características de PDAC6humano. Sin embargo, en cuanto a todos los modelos transgénicos, el programa de cría es costoso, la progresión tumoral es variable y, por lo tanto, a menudo requiere grandes cohortes de ratones. Los modelos PDX utilizan células tumorales derivadas del paciente o piezas que luego se cultivan ortopédicamente o más a menudo por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos. Los modelos Xenograft proporcionan herramientas útiles para el cribado de compuestos terapéuticos y tienen en cuenta la heterogeneidad del paciente. Sin embargo, no proporcionan un microambiente inmune completo, limitando así sus aplicaciones8,9.
Una vez establecidos, los tumores ortotópicos suelen tardar alrededor de 1 mes o más en crecer (dependiendo de la línea celular utilizada) y forman tumores grandes que pueden ser fácilmente imageados por ultrasonido o RMN para realizar un seguimiento de la progresión y determinar la eficacia del tratamiento4,5,10. Sin embargo, una vez en crecimiento exponencial, la última fase del crecimiento tumoral puede ser rápida, por lo que la mayoría de los regímenes de tratamiento se inician relativamente temprano (por ejemplo, 14 días)11,12. El sistema inmunitario desempeña un papel crítico en el desarrollo tumoral, incluso en el PDAC, que se caracteriza por un infiltrado tumoral inmunosupresor con escasez relativa de células T y presencia frecuente de células mieloides13. Una alta presencia de células T en PDAC confiere un mejor pronóstico14,15. Sin embargo, como agentes individuales, los inhibidores del punto de control inmune que alivian la inmunosupresión de células T, como anti-CTLA-416 y anti-PD-L117,no han mostrado beneficio clínico en pacientes con PDAC, probablemente porque la reactividad general de los tnéficos es muy baja. Sin embargo, los agentes que priman las respuestas de los células T, como el anti-CD40, pueden superar la resistencia anti-PD-L1/CTLA-418,19 y la vacunación con la vacuna primaria-CSF PDAC (GVAX) puede aumentar la inmunogenicidad de los tumores PDAC20,lo que indica que la mejora de las respuestas a los células T forma una importante vía terapéutica.
La respuesta antitumoral de los linfocitos T es el reconocimiento de antígenos derivados de tumores a través del receptor de células T (TCR) y la posterior producción de citoquinas y gránulos citotóxicos. Mientras que el reconocimiento del antígeno de células T se puede determinar mediante la secuenciación de TCR, este enfoque es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, la cuantificación de los subconjuntos de células T infiltrantes de tumores proporciona una buena indicación de una respuesta antitumoral. Un examen más profundo de la actividad de los células T ex vivo en términos de degranulación, producción de citoquinas y otros factores citotóxicos proporciona un análisis funcional más profundo. Estos ensayos se pueden realizar en muestras de tumores frescos y muchos parámetros de la función de los células T se pueden medir rápidamente mediante citometría de flujo.
Los células CD8+ y CD4+ T producen citoquinas como IFN y TNF para potenciar una respuesta inmune21. IFN induce la regulación del MHCI sobre las células diana, induce la diferenciación y el reclutamiento de células inmunitarias y ayuda a la muerte celular. La producción de IFN por células CD8+ T está bien caracterizada por formar parte de una respuesta antitumoral y se correlaciona con la regresión tumoral22,23. El TNF es otra citoquina proinflamatoria producida por las células CD8+ y CD4+ T. Mejora la activación dependiente de TCR y la proliferación de células T, ayudando a la respuesta antitumoral. Tras el compromiso con TCR, los células cd8+ T citotóxicas pueden sufrir degranulación, donde los lisosomas secretores preformados que contienen moléculas citotóxicas se liberan en la sinapsis inmunológica para causar la degradación de las células diana21. Estas moléculas incluyen Perforin, una proteína que se une a la membrana celular diana, formando poros que luego alteran la integridad de la membrana y permiten la difusión21 o endocitosis24 de otras moléculas citotóxicas, como Granzyme B, directamente en el citoplasma de la célula diana. Granzyme B es una proteasa que promulga la degradación de múltiples proteínas dentro de la célula diana, lo que lleva a la muerte celular21. La liberación de tales moléculas requiere exócitosis de endosomas a la superficie celular, donde el marcador endosomal CD107a (también conocido como LAMP-1) se incorpora transitoriamente a la membrana celular25.
La medición de la secreción de citoquinas por células T requiere su aislamiento mediante la clasificación de células asistidas por flujo o ensayos de separación basados en cuentas, que no se pueden realizar fácilmente en un gran número de muestras simultáneamente. Sin embargo, la medición de citoquinas intracelulares no requiere ningún paso previo al aislamiento y se puede realizar fácilmente en varias muestras a la vez, lo que permite un enfoque de mayor rendimiento. Como las citoquinas son secretadas rápidamente por las células T, los niveles intracelulares pueden ser indetectables y por lo tanto la célula T requiere estimulación para aumentar la producción basal de citoquinas. Para evaluar la producción de citoquinas impulsada por antígenos, el antígeno reconocido por el TCR debe presentarse a la célula T mediante un APC in vitro cebado. En los casos en que no se conoce la especificidad del antígeno, se requiere un enfoque de estimulación amplio. La estimulación TCR se puede imitar utilizando perlas anti-CD3/28 que proporcionan activación de TCR y coestimulación, lo que induce la producción y proliferación de citoquinas. Sin embargo, una alternativa más rentable es el uso de PMA y ionomicina, que en conjunto activan ampliamente las vías de señalización que conducen a la síntesis y liberación de citoquinas intracelulares. Específicamente, pmA activa la proteína quinasa C (PKC) y la ionomicina aumenta los iones Ca2+ intracelulares, lo que conduce a una mayor señalización celular. Con el fin de preservar el contenido intracelular de citoquinas, esta estimulación se puede combinar eficazmente con inhibidores del transporte de proteínas brefeldina A y monensina, que bloquean las proteínas en el Golgi y así prevenir la liberación extracelular. El uso de PMA/ionomicina es un método bien establecido para estimular las células T y existe una fuerte correlación entre las citoquinas extracelulares e intracelulares26. La estimulación de las células T con PMA y ionomicina también aumenta el tráfico de lisosoma a la membrana celular y por lo tanto CD107a se integra transitoriamente en la superficie celular antes de ser reciclado en la célula. Al incluir un anticuerpo anti-CD107a durante la estimulación, es posible utilizarlo como un marcador de la actividad de desgranulación25.
Este método digiere rápidamente los tumores para proporcionar una suspensión de una sola célula. En este punto, las poblaciones individuales pueden ser teñidas directamente para la citometría de flujo o purificadas por métodos aguas abajo: clasificación de células asistidas por flujo o separación de perlas magnéticas. La preparación de una suspensión de una sola célula para el análisis de citometría de flujo permite el análisis de alto rendimiento de múltiples poblaciones de células inmunitarias y sus marcadores fenotípicos, proporcionando una cuantificación precisa del número de células inmunitarias y el fenotipo.
Por último, el protocolo de digestión descrito aquí previene la pérdida de marcadores de superficie celular y mantiene la viabilidad de las células inmunitarias, permitiendo que las células inmunitarias se sometan a más pasos de purificación celular y cultivo según sea necesario. Sin embargo, este método no ha sido probado para derivar células epiteliales de esta digestión.
Los modelos in vivo del cáncer de páncreas proporcionan herramientas inestimables para comprender la progresión de la enfermedad y evaluar nuevas dianas terapéuticas3. El modelo ortotópico en particular es un modelo rentable y reproducible que se puede aplicar en grandes cohortes de ratones simultáneamente4,27. El modelo ortotópico también proporciona el microambiente cognado y el sistema inmune intacto para el crecimiento tumoral, por lo que es más apropiado que los modelos subcutáneo y PDX. Sin embargo, hemos encontrado que algunos elementos de infiltración inmune pueden diferir entre el modelo ortotópico y ratones KPC, el estándar de oro murino modelo10. Una razón para esto podría ser el crecimiento acelerado del tumor visto en el modelo ortotópico. Se han descrito otras diferencias en la densidad de los subconjuntos de células inmunitarias entre los modelos ortotópicos y subcutáneos3,28. Por lo tanto, aunque el modelo transgénico de KPC es más costoso y variable6,los hallazgos clave deben verificarse en una pequeña cohorte de ratones KPC siempre que sea posible.
La preparación de células tumorales para la cirugía ortotópica es un paso crítico en el protocolo. Las células siempre deben estar en la fase log del crecimiento y sin micoplasma y sin infecciones. La cirugía ortotópica debe posponerse si hay alguna preocupación sobre el crecimiento de las células tumorales. El uso de membrana del sótano mejora la tasa de incidencia tumoral sobre las células inyectantes sinella 29 y reduce la fuga celular y, por lo tanto, la propagación peritoneal27. Sin embargo, una vez suspendidas en la membrana del sótano, las células tumorales deben inyectarse rápidamente (dentro de 2 horas) para evitar cualquier pérdida celular. Es probable que el número de células tumorales necesarias para generar tumores dependa de la línea celular, y se debe analizar un rango de números celulares (por ejemplo, de 100 a 100.000) que también puede determinar el tiempo para alcanzar el punto final. Es probable que haya un margen de error al preparar 1.000 celdas por ratón para inyección; por lo tanto, si se requieren varios días de cirugía, el tratamiento de los grupos debe extenderse por igual a lo largo de los días para controlar los efectos por lotes. La mayoría de los pasos quirúrgicos se pueden modificar dependiendo de las preferencias; sin embargo, se debe tener cuidado de no alterar la membrana del sótano al reemplazar el páncreas en la cavidad abdominal o cerrar la pared peritoneal. La fuga de membrana del sótano puede causar crecimiento de las células tumorales en la pared peritoneal, que se forman rápidamente y pueden resultar en tener que sacrificar al animal antes.
Idealmente, los tumores pancreáticos deben digerirse rápidamente después de la cosecha y prepararse para la estimulación ex vivo inmediatamente. Sin embargo, esto podría no ser posible si hay un gran lote de tumores para cosechar, en este caso los tumores deben mantenerse en hielo y digerirse en lotes. Se ha demostrado que el tipo, la concentración y la duración de la exposición a las enzimas digestivas afectan a un gran número de moléculas superficiales en las células inmunitarias30,31,32. El tiempo de digestión también es deliberadamente corto para limitar la muerte celular33. Las células digeridas se pueden congelar en medio de congelación para almacenamiento a largo plazo; sin embargo, alguna pérdida celular ocurrirá al descongelarse. El proceso de digestión puede ser menos que óptimo si las piezas tumorales no están suficientemente cortadas en cubos antes de la incubación de la colagenasa y esto será evidente ya que las piezas tumorales duras permanecerán en el filtro después de la digestión. La concentración de colagenasa se puede reducir si se trabaja con páncreas sano o tumores en estadio temprano; informes sobre la extracción de células ductales pancreáticas saludables utilizan concentraciones significativamente más bajas34. Un alto grado de muerte celular epitelial es de esperar durante la digestión; sin embargo, las células inmunitarias deben tolerar bien el proceso. Existen métodos alternativos para aislar células epiteliales viables para el crecimiento organoide35 o para preservar la arquitectura tisular36.
Las modificaciones al protocolo de estimulación se pueden hacer fácilmente, dependiendo de la lectura deseada y la célula inmune analizada (por ejemplo, macrófagos o células B). El uso de reactivos panestimuladores PMA/ionomicina no discrimina por la especificidad del antígeno TCR, por lo que es útil cuando no se conoce el antígeno. Sin embargo, la producción de IFN está estrechamente asociada con la contratación de TCR37 y tanto la producción de IFN como la TNF son críticas en las respuestas antitumorales del PDAC38. La estimulación de la PMA/ionomicina refleja la capacidad máxima de las células T para producir citoquinas, que podrían o no ser producidas por las células T dentro del microambiente tumoral. La producción endógena se puede medir sin necesidad de estimulación; sin embargo, los niveles pueden ser mucho más bajos o indetectables. Existen métodos alternativos para estimular las células T: cuentas recubiertas anti-CD3/28, que tampoco requieren antígeno o, de hecho, otras poblaciones de células inmunitarias. La ventaja de este método es permitir la cuantificación de la producción de citoquinas por subconjuntos específicos de células T sin necesidad de métodos de separación. También se pueden añadir otros marcadores de citotoxicidad (granzim, B y Perforin A), actividad (IL-2) o inmunosupresión (IL-10)21. Sin embargo, los anticuerpos de citometría de flujo de alta calidad no están disponibles para detectar todas las citoquinas y factores de interés. Por lo tanto, si hay otras aplicaciones como ELISA requerida la estimulación se puede realizar sin la inclusión de brefeldina A/monensina, permitiendo la liberación de citoquinas en el sobrenadante. Sin embargo, cabe destacar que esto permitirá la liberación total de citoquinas celulares y no será posible determinar qué poblaciones celulares contribuyeron.
La producción de IFN es una característica dominante de una respuesta antitumoral de células T, a menudo utilizada como sustituto del reconocimiento TCR-antígeno37,38. Otros métodos in vivo que definen con mayor precisión respuestas específicas del antígeno utilizan células tumorales que expresan un antígeno conocido, como Ovalbumin o SV40. El antígeno universal se puede utilizar ex vivo para probar el reconocimiento de células T o en combinación con un ratón host restringido por TCR. Alternativamente, cuando se desconoce el antígeno, la cuantificación de la expansión clonal de células T se puede realizar mediante la secuenciación tOCR a granel, o más recientemente la secuenciación tCR de una sola célula39,40. Para comprender plenamente el estado de la respuesta intratumoral de los linfocitos T, también se deben medir marcadores indicativos de agotamiento o receptores inhibitorios, entre los que se incluyen: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Así como marcadores de células T efectoras (CD44hi,CD62lo)y actividad proliferativa, Ki67+ o CSFE dilución41,42,43,44. En general, el modelo ortotópico proporciona una plataforma útil para probar rápidamente estrategias terapéuticas, en particular que pueden modular la respuesta antitumoral de células T, que luego se puede validar en una cohorte más pequeña de ratones transgénicos, KPC.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer al Servicio de Técnicos Animales y a la Dra. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su asistencia durante la cirugía ortotópica. También queremos agradecer a la Dra. Jennifer Morton (Instituto Beatson para la Investigación del Cáncer, Glasgow, Reino Unido) por su orientación en técnica quirúrgica, la Dra. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su consejo sobre la digestión tumoral y la Dra. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su asesoramiento en relación con los protocolos de estimulación celular ex vivo T. También queremos dar las gracias al Consejo de Investigación Médica (MRC), al Fondo de Investigación del Cáncer de Páncreas (PCFR) y a la Acción del Cáncer de Ovario, que financió esta investigación.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |