Målet med denna studie är att modifiera råtta orthotopic lever transplantation modell för att bättre representera människors levertransplantation och förbättra mottagarens överlevnad. Den presenterade metoden reestablishes lever kranskärlens inflöde genom att ansluta givaren leverns gemensamma lever gatan till mottagaren leverns korrekt lever gatan.
Råtta orthotopic lever transplantation (OLT) modell är ett kraftfullt verktyg för att studera akut och kronisk avstötning. Det är dock inte en fullständig representation av mänskliga lever transplantation på grund av avsaknad av kranskärlens återanslutning. Beskrivs här är en modifierad transplantation förfarande som omfattar införlivandet av lever gatan (HA) återanslutning, vilket leder till en markant förbättring av transplantation resultat. Med en genomsnittlig anhepatisk tid på 12 min och 14 s resulterar HA återanslutning i förbättrad perfusion av den transplanterade levern och en ökning av långsiktig mottagaröverlevnad från 37,5% till 88,2%. Detta protokoll inkluderar användning av 3D-tryckta manschetter och hållare för att ansluta portalvenen och infrahepatic inferior vena cava. Det kan genomföras för att studera flera aspekter av levertransplantation, från immunsvar och infektion till tekniska aspekter av förfarandet. Genom att införliva en enkel och praktisk metod för arteriell återanslutning med hjälp av en mikrovaskulär teknik, denna modifierade råtta OLT-protokollet noggrant härmar aspekter av mänskliga lever transplantation och kommer att fungera som en värdefull och kliniskt relevant forskningsmodell.
Den globala bördan av leversjukdom fortsätter att öka, med en 30% ökning av leversjukdom-relaterade dödsfall från 2005 till 20131,2. Levertransplantation är ofta den enda utvägen för patienter med leversjukdom i slutstadiet. Levern är den näst mest transplanterade fasta organ, och antalet levertransplantationer som utförs globalt ökade med 7,25% från 2015 till 20161,2. Trots dess prevalens, efter transplantation överlevnad har blivitstagnerade 3,4,5. Den 15 år patientens överlevnad rapporteras vara 53%, och den 20 år patienten överlevnad kan vara så låg som 21%3,5. Även om det finns spännande nya immunobiologi initiativ som kan leda till nya behandlingar och förbättrade kliniska resultat, det finns ännu inte en tillförlitlig små djur modell för att testa dem.
Råttan OLT-modellen har använts i stor utsträckning vid utredning av levertransplantation, inklusiveavstötning 6,7,8,9,10, immuntolerans11, transplantation ischemi-reperfusion skada12, immunsuppression13, och biliär trädskada14,15,16,17. En nackdel med modellen i sin nuvarande form är dock dess höga postoperativa sjuklighet ochdödlighet 18,19. Detta är en allvarlig nackdel som står i strid med den mänskliga operationen, och det äventyrar förmågan att dra kliniskt relevanta slutsatser från modellen20.
Dessutom kan en stor del av denna sjuklighet tillskrivas en frånvarande eller ofullkomlig leverartär (HA) återanslutning18. Även om ett kritiskt steg i mänskliga lever transplantation, tekniska svårigheter tenderar att äventyra HA återanslutning i modellen råtta OLT. Som ett resultat är gallgången (BD) anastomos svag och resulterar i höga andelen gallläckage och BD nekros21. Bortom den höga förekomsten av biliär komplikationer22, en avsaknad av arteriellt inflöde förändrar fysiologi graft levern efter transplantation23, med hypoxi i givaren levern graft24 och leverskador observerats i inflammerade lober19,25,26. Rat OLT utan arteriell återanslutning tenderar också att främja fibros27. Den råtta OLT protokoll beskrivs nedan behandlar dessa frågor genom att införliva en enkel HA återuppbyggnad steg med en tidigare publicerad råtta OLT metod28, vilket resulterar i bevarande av lever parenkym och förbättrad överlevnad priser.
Levertransplantation har tre faser: (1) utvinning av levertransplantatet från donatorn, (2) beredning av givarens levertransplantat och (3) ersättning av mottagarlever med levertransplantat. Förfarandet innebär manipulering av fem anatomiska strukturer: suprahepatic sämre vena cava (SHVC), portal ven (PV), infrahepatic sämre vena cava (IHVC), leverartären (HA), och gallgången (BD).
OLT i råttan först infördes av Lee et al. med hjälp av mikrosutur anastomos av SHVC, PV och IHVC, och en pull-through teknik för BD29. Denna modell förbättrades senare genom användning av tvåmanschetttekniken 197930. Sedan dess har flera alternativa tekniker föreslagits, med majoriteten fokuserar på venös anastomos och med hjälp av en två-manschett teknik med några ändringar31. Även om HA anastomos har beskrivits tidigare i råtta OLT-modellen med tekniker som mikrosutur, manschett, och intraluminal ärmar26,31,32,33,34, dessa tekniker kräver ofta högutbildade mikrokirurgiska färdigheter, avsevärt förändra råtta fysiologi, och hindras av trombos och /eller biliary komplikationer27,35.
Vidare kan valet av kirurgiskt ingrepp också påverka anhepatic tiden (tid från PV fastspänning till reperfusion av transplantat genom den rekonstituerade PV), vilket är avgörande för framgången för råtta lever transplantation. Specifikt, höga överlevnadstal observeras med anhepatic gånger 15-20 min36, och 30 min är den övre gränsen för framgång37,38. Därför är målet med denna metod att genomföra en mindre invasiv och lättare adoptable kirurgiska råtta OLT modell som är kunna återansluta den leverartär, främja effektiv perfusion av den transplanterade levern, upprätthålla flödet till mottagaren gallgången, och bevara mottagarens fysiologiska tillstånd.
Detaljerade här är alla steg i detta reviderade protokoll, inklusive manipulering av celiaki stammen av givaren levern samt användning av 1) en 1,5 mm stent att utföra en extraluminal hylsa samband med mottagaren korrekt HA, 2) en löpande sutur för SHVC-rekonstruktionen, 3) två 3D-tryckta plastmanschetter för PV och IHVC-rekonstruktion39,40, 4) en mikrovaskulär hylsans återanslutning för HA18,27,41 och 5) en tidigare beskriven BD-stentingteknik28. Två ytterligare steg ingår också: en kall spolning via PV, och en antibiotika regim som är baserad på tidigare resultat17. Denna optimerade OLT protokoll minimerar perioperativ komplikationer och sjuklighet och närmare modeller det kirurgiska operativa ingreppet som används i mänskliga lever transplantation.
Små djur lever transplantation modeller är viktiga för att förstå transplantation immunitet och identifiera nya terapeutiska strategier32. Den idealiska smådjurs lever transplantation modellen replikerar alla steg i det mänskliga förfarandet, inklusive arteriell anastomos. Det kan vara utmanande att tolka resultat från råtta OLT-modellen, eftersom de flesta versioner inte innehåller en HA anastomos steg, vilket leder till högre frekvens av komplikationer och sjuklighet42. Vissa rekonstruktionsprocedurer har använt njurartären, vilket kräver avlägsnande av njuren27. Detta protokoll undviker avlägsnande av organ, eftersom det är bortom vad som sker i det mänskliga förfarandet.
Arteriella rekonstruktioner kan också utföras genom att manipulera råttan aorta31. Dessa metoder kräver dock omfattande dissektion och fastspänning av stora stora stora delar. Om klämman tiden är långvarig, då mottagaren råtta kommer att ha dåliga resultat relaterade till distala ischemi43. Hos människor innebär en LT kirurgisk teknik ligering och delning av mottagaren gastroduodenal artär (GDA). Men de fysiologiska och anatomiska funktionerna hos gnagare gör transplantation med hjälp av denna teknik mer fysiologiskt utmanande och kan leda till komplikationer (dvs. nekros i bukspottkörteln och gallgången35 och gallläckage44). Den arteriella återanslutning i detta protokoll är avsedd att kringgå denna utmaning, upprätthålla kanal blodflödet, och förbättra mottagarens resultatet.
Användningen av en hylsa och stenting teknik för återuppbyggnad av råttan HA har beskrivits tidigare27. I denna teknik, en stent används som en guide, och artären rekonstrueras från givaren celiac trunk till mottagaren gemensamma HA. Mottagaren gemensamma HA sedan dissekeras ut, och mottagaren GDA är bunden av27. Som ett resultat, blodtillförseln till den nedre delen av mottagaren BD och chef för bukspottkörteln kan bli äventyras. Man tror att säkerheten cirkulationen till detta område ofta ger otillräckligt blodflöde till gallgången. Till exempel, detta protokoll test-klämmer mottagaren GDA först med en mikrovaskulär klipp, sedan delar mottagaren BD. Med GDA fastklämd blöder inte den delade BD. Efter att GDA-klämman avlägsnats observeras rask blödning från BD. Detta protokoll, som upprätthåller bra flöde till den delade mottagaren gallgången, skyddar fysiologi mottagaren levervävnad genom att tillhandahålla adekvat lever blodperfusion och förhindra post-OLT hypoxisk lever skada.
På givarsidan, HA stent sätts in i celiac bålen under beredningen av transplantatet med lätthet genom att skapa ett plåster från celiac stammen, vänster mag artär och splenic gatan. Stenten kan sättas in genom den breda öppningen, vilket är mindre svårt än att försöka föra in stenten i celiacstammen ensam. Det har konstaterats att 24 G är en idealisk storlek att använda för HA-stenten. Stentens längd ska vara 1,0-1,5 mm lång, eftersom den fungerar som en öppen grind för att mottagarens rätta HA lätt ska dras in i donatorns gemensamma HA. Med noggrann uppmärksamhet på var 10-0 ethilon suturen är placerad, kommer blod som flyter genom denna anslutning aldrig röra stenten direkt, och mottagarens korrekt HA kommer att skydda den från insidan, vilket minskar risken för komplikationer. Viktigt är att donatorns HA aldrig kläms fast för att undvika vasospasm. Framgången för kranskärlens återuppbyggnad utvärderas genom att lämna givaren GDA öppen. Framgångsrika anastomos resulterar i bra blodflödet från givaren GDA när återuppbyggnaden är klar.
I detta protokoll, liknande andra, shvc återanslutning är det långsammaste steget och slutligen dikterar varaktigheten av anhepatic fasen. Eftersom varaktigheten av den anhepatic tiden ökar, risken ischemisk skada och leverdysfunktion ökar45. En annan kritisk komponent i OLT råtta modeller är storleken på transplantatet, stent, och manschetter. Om transplantatet är för litet kan transplantatet vridas eller vända, vilket hindrar kärlanslutningarna. Storleken på stent och manschetter kan kräva justeringar efter ålder, kön, vikt, och stam av råttan. Storleken på manschetterna som används här valdes som tidigare beskrivits28, och en manschettstorlek som kontrollerade för råttans storlek användes. Det fanns inga tecken på nöd eller komplikationer (dvs. lever trängsel, ödem, ascites eller splenomegali) under uppföljningsperioden (hittills: median = 133 dagar efter operationen, minimum = 115 dagar post-op, max = 161 dagar post-op). Ytterligare studier för att bestämma den lämpliga storleken på PV och IHVC för olika råtta stammar står för både ålder och kön är motiverade.
Detta modifierade RAT OLT-protokoll använder 3D-printade manschetter för PV och IHVC, som beskrivitstidigare 39,40. Befintliga metoder för att ansluta PV och IHVC inkluderar en mikrosuturteknik32, manschettteknik46, och mikrosutur-tillfällig skenateknik47. Den 3D-tryckta manschetttekniken valdes, eftersom den gör att manschettens storlek kan standardiseras enligt råttastammen och är lätt att förbereda och använda. Stora mängder manschetter med samma mått kan skrivas ut på en gång. Manschettens ytteryta har två räfflor som hjälpmedel med säkringsband och förhindrar glidning. En svans är också införlivas i manschetten design för att möjliggöra enklare manipulation av manschetten. Sammantaget, Man tror att införliva 3D-tryckta manschetter leder till hög framgång och reproducerbarhet av OLT-förfarandet genom att förkorta anhepatic tid. Det är fast att denna teknik också förkortar den kirurgiska inlärningskurvan.
Sammanfattningsvis fastställde det beskrivna protokollet en modell som är mer lik mänskliga lever transplantation genom att införliva en kranskärlens återanslutning steg. Detta protokoll kan anpassas för att studera många immunologiska och kirurgiska aspekter av lever transplantation och kan fungera som en modell för att testa nya terapeutiska interventioner relevanta för transplantation.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades genom medel från Multi-Organ transplantation programmet vid UHN och stöd från Toronto General och Toronto Western Foundation.
10-0 Ethilon | Ethicon | 2830G | 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper |
10mL Syringe | BD | B302995 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
1mL Syringe | BD | B309628 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
20mL Syringe | BD | B301031 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
3D Printed Cuff for IHVC | Custom | ||
3D Printed Cuff for PV | Custom | ||
3D Printed Holder for IHVC | Custom | ||
3D Printed Holder for PV | Custom | ||
3mL Syringe | BD | B309657 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
4-0 Sofsilk | Coviden | GS-835 | Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle |
5-0 Monocryl | Ethicon | Y433H | Undyed Monofilament 1X27" TF |
5mL Syringe | BD | B309646 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
7-0 Silk | Teleflex Medical | 103-S | Black |
8-0 Prolene | Ethicon | 2775G | 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed |
Barraquer Micro Needle Holder Without Catch | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | Curved 120 mm, 4 3/4″ |
Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-025T | Small Size, Titanium |
Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-021T | Small Size, Titanium |
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN | BD Angiocath / Autoguard | 382523 | 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min |
BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel – Regular Wall. | BD | B305106 | PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G |
BD Precisionglide Syringe Needle 21G | BD | 305167 | Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle |
BD Precisionglide Syringe Needle 30G | BD | 305128 | Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle |
Betadine Solution by Purdue Products LP | Purdue Products Lp | 67618-150-17 | 10% povidone–iodine topical solution USP |
Bupivacaine Injection BP 0.5% | SteriMax Inc. | DIN:02443694 | 0.5% (100mg/20mL) |
Curved Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-501E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm |
DC Temperature Controller | FHC Inc. | 40-90-8D | |
DK Iris Scissors (Curved) | Duckworth & Kent | 1-211B | Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm |
Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs | Decon Labs, Inc. | 2716 | Dilute to 70% with d2H2O |
Fine Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Appartus Limited | 34-1040SV | |
Heparin LEO(heparin sodium) | LEO Pharma Inc. | DIN:00453811 | 10,000 i.u./10 mL |
Ice-Pak | Cryopak | FIP88016 | 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch |
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% | Piramal Healthcare Limited | DIN: 02231929 | 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25 |
Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps | Duckworth & Kent | 2-502N | 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm |
Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL | Baxter Co. | DIN: 00061085 | JB2324 |
McPherson Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-500E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm |
Metzenbaum Scissors – 14.5 cm | Fine Science Tools | 14024-14 | Straight Sharp/Blunt |
Micro Kitzmiller Clamp | Scanlan | 3003-630 | Jaw length 23mm, Length 11cm |
Microscope-Leica M525 F20 | Leica Microsystems | No catalog number | |
Non-woven Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-028-556 | |
Olsen-Hegar with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface – 14cm |
OptixCare Eye Lube, 25gm | OptixCare | ES-KE8O-69U1 | Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant |
Piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | P8396 | Penicillin analog |
Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company LLC | 803-WC | Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle |
Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock | Fine Science Tools | 12075-12 | Round handles allow easy fingertip adjustments – 12.5cm |
Shea Scissors Curved Blunt | Fine Science Tools | 14105-12 | Transplant scissors with light and delicate pattern – 12cm |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 4mm | Fine Science Tools | 18055-06 | Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 6mm | Fine Science Tools | 18055-05 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g |
Stainless Steel Micro Serrefines Straight – 6mm | Fine Science Tools | 18055-03 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g |
Surgical Platform | Custom, magnetic | ||
SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine | General Anesthetic Services, Inc | V7015 | |
T/Pump Localized Therapy | Stryker | TP700 Series | |
Vacuum-Pressure Pump | Barnant Co. | 400-1901 | |
Vannas Scissors with Microserrations Straight | Fine Science Tools | 15070-08 | Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm – 8.5cm |
Vetergesic Buprenorphine | Ceva Animal Health Ltd | NAC No.:12380352 | 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats |
Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit | Summit Hill Laboratories | No catalog number |