Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente
Summary
Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.
Abstract
Aquí presentamos un enfoque integrador para probar la eficacia de las terapias dirigidas que combina la próxima generación de tecnolo-gies de secuenciación, análisis de diana terapéutica y monitoreo de la respuesta a fármacos utilizando xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Esta estrategia fue validada utilizando tumores ováricos como ejemplo. El protocolo de secuenciación de próxima generación (MPseq) de pareja de relaciones de posición se utilizó para identificar alteraciones estructurales y siguió el análisis de alteraciones potencialmente objetivos. Los tumores humanos cultivados en ratones inmunocomprometidos fueron tratados con medicamentos seleccionados en base a los análisis genómicos. Los resultados demostraron una buena correlación entre las respuestas predichas y las observadas en el modelo PDX. El enfoque presentado se puede utilizar para probar la eficacia de los tratamientos combinados y ayudar a un tratamiento personalizado para pacientes con cáncer recurrente, específicamente en los casos en que la terapia estándar falla y hay una necesidad de usar medicamentos fuera de etiqueta.
Introduction
Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), que se generan a partir de la implantación de piezas tumorales de pacientes en ratones inmunodeficientes, han surgido como un potente modelo preclínico para ayudar a la atención personalizada contra el cáncer. Los modelos PDX han sido desarrollados con éxito para una variedad de neoplasias malignas humanas. Estos incluyen cáncer de mama y ovario, melanoma maligno, cáncer colorrectal, adenocarcinoma pancreático, y cáncer de pulmón de células no pequeñas1,,2,3,4,5. El tejido tumoral se puede implantar ortotópica o heterotópicamente. El primero, considerado más preciso pero técnicamente difícil, implica el trasplante directamente en el órgano de origen tumoral. Se cree que este tipo de modelos imitan con precisión la histología del tumor original debido al microambiente “natural” para el tumor6,,7. Por ejemplo, el trasplante ortotópico en la bursa del ovario de ratón dio lugar a la diseminación del tumor en la cavidad peritoneal y la producción de ascitis, típica del cáncer de ovario8. Del mismo modo, la inyección de tumores de mama en el torácico en lugar de la glándula mamaria abdominal afectó la tasa de éxito y el comportamiento de LA PDX9. Sin embargo, los modelos ortotópicos requieren sofisticados sistemas de diagnóstico por imágenes para monitorear el crecimiento tumoral. La implantación heterotópica del tumor sólido se realiza típicamente mediante la implantación de tejido en el flanco subcutáneo de un ratón que permite una monitorización más fácil del crecimiento tumoral y es menos costosa y consume mucho tiempo7. Sin embargo, los tumores crecidos por vía subcutánea rara vez metástasis a diferencia de como se observó en el caso de la implantación ortotópica10.
Se ha demostrado que la tasa de éxito del injerto varía y depende en gran medida del tipo de tumor. Se informó que los tumores más agresivos y los muestras de tejido que contenían un porcentaje más alto de células tumorales tenían mejores tasas de éxito12,,13. De acuerdo con esto, se demostró que los tumores derivados de sitios metastásicos se injertaban a frecuencias de 50-80%, mientras que los de sitios primarios ingrafales a frecuencias tan bajas como 14%12. Por el contrario, el tejido que contiene células necróticas y menos células tumorales viables injerta mal. El crecimiento tumoral también se puede promover mediante la adición de proteínas de matriz de membrana sótano en la mezcla de tejido en el momento de la inyección en ratones14 sin comprometer las propiedades del tumor original. También se encontró que el tamaño y el número de piezas de tejido destinadas a la implantación afectan la tasa de éxito del injerto. Se notificaron mayores tasas de toma de tumor para la implantación en la cápsula subrre renal en comparación con la implantación subcutánea debido a la capacidad de la cápsula subrre renal para mantener el estroma tumoral original y proporcionar las células estromales del huésped, así15.
La mayoría de los estudios utilizan ratones inmunodeficientes NOD/SCID, que carecen de células asesinas naturales16 y se ha demostrado que aumentan el injerto tumoral, el crecimiento y la metástasis en comparación con otras cepas14. Sin embargo, se requiere un monitoreo adicional, ya que pueden desarrollar linfomas timicos tan pronto como 3-4 mes de edad13. En los trasplantes de tumores ováricos cultivados en ratones SCID, el crecimiento de las células B fue inhibido con éxito por rituximab, impidiendo el desarrollo de linfomas pero sin afectar el injerto de tumores ováricos17.
Más recientemente, NSG (NOD. Los ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), portadores de una mutación nula en el gen que codifica la cadena gamma del receptor18de interleucina 2, se convirtieron en una cepa utilizada con frecuencia para la generación de modelos PDX. Se informa que los tumores de los modelos PDX establecidos a las generaciones futuras de ratones conservan propiedades histológicas y moleculares de 3 a 6 generaciones19,,20. Numerosos estudios han demostrado que los resultados del tratamiento en los modelos PDX imitan a los de sus pacientes correspondientes2,,3,4,21,22,23. La tasa de respuesta a la quimioterapia en los modelos PDX para el cáncer de pulmón no pequeño y los carcinomas colorrectales fue similar a la de los ensayos clínicos para los mismos fármacos24,,25. Los estudios realizados en modelos PDX, desarrollados para pacientes inscritos en ensayos clínicos, demostraron respuestas a fármacos probados similares a los observados clínicamente en pacientes correspondientes2,,3,,4.
Los análisis genómicos de alto rendimiento de un tumor de paciente junto con los modelos PDX proporcionan una poderosa herramienta para estudiar correlaciones entre alteraciones genómicas específicas y una respuesta terapéutica. Estos se han descrito en algunas publicaciones26,27. Por ejemplo, las respuestas terapéuticas al inhibidor del EGFR cetuximab en un conjunto de modelos de PDX colorrectal que llevan amplificación de EGFR, respuestas clínicas paralelas a cetuximab en pacientes28.
Hay algunos desafíos asociados con el desarrollo y la aplicación de modelos PDX. Entre ellos se encuentra la heterogeneidad tumoral29,30 que puede comprometer la precisión de la interpretación de la respuesta al tratamiento como un clon de una sola célula con mayor capacidad proliferativa dentro de un PDX puede superar a los otros31,lo que resulta en una pérdida de heterogeneidad. Además, cuando se utilizan biopsias de un solo tumor para desarrollar PDX, algunas de las poblaciones celulares pueden perderse y no estarán representadas en el injerto final. Se recomiendan varias muestras del mismo tumor para que la implantación resuelva este problema. Aunque los tumores PDX tienden a contener todos los tipos celulares del tumor donante original, estas células se sustituyen gradualmente por las de origen murino3. La interacción entre el estroma murino y las células tumorales humanas en los modelos PDX no se entiende bien. Sin embargo, se demostró que las células estromales recapitulan el microambiente tumoral33.
A pesar de estas limitaciones, los modelos PDX siguen siendo una de las herramientas más valiosas para la investigación traslacional, así como la medicina personalizada para seleccionar terapias para pacientes. Las principales aplicaciones de los PDX incluyen el descubrimiento de biomarcadores y las pruebas de drogas. Los modelos PDX también se utilizan con éxito para estudiar los mecanismos de resistencia a los medicamentos e identificar estrategias para superar la resistencia a los medicamentos34,,35. El enfoque descrito en el presente manuscrito permite al investigador identificar posibles dianas terapéuticas en tumores humanos y evaluar la eficacia de los fármacos correspondientes invivo, en ratones que albergan tumores injertados que inicialmente se caracterizaron genómicamente. El protocolo utiliza tumores ováricos injertados por vía intraperitoneal, pero es aplicable a cualquier tipo de tumor lo suficientemente agresivo para crecer en ratones2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos el enfoque y los protocolos que utilizamos para llevar a cabo un “ensayo clínico” en modelos PDX que aprovecha las características moleculares del tumor obtenidas por el perfil genómico para determinar la mejor elección de fármacos para las pruebas. Actualmente se utilizan múltiples plataformas de secuenciación para la caracterización genómica de tumores primarios, incluida la secuenciación del genoma completo, RNAseq y paneles genéticos personalizados. Para el carcinoma ovárico seroso de alto gra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Individualizada (CIM) de Mayo Clinic, Dr. Lin Yang y Faye R. Harris, MS, por la ayuda en la realización de experimentos. Este trabajo fue apoyado por el Regalo del Sr. y la Sra. Neil E. Eckles al Centro de Medicina Individualizada (CIM) de Mayo Clinic.
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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