Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris
Summary
Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d’ARNm de cellules simples pour profiler l’expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l’ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.
Abstract
Le séquençage de l’ARNm à cellule unique a fait des progrès significatifs au cours des dernières années et est devenu un outil important dans le domaine de la biologie du développement. Il a été utilisé avec succès pour identifier les populations de cellules rares, découvrir de nouveaux gènes marqueurs et décoder l’information sur le développement spatial et temporel. La méthode à cellule unique a également évolué de la technologie Fluidigm C1 à base de microfluidique aux solutions à base de gouttelettes au cours des deux à trois dernières années. Ici, nous avons utilisé le cœur comme un exemple pour démontrer comment profiler les cellules de tissu embryonnaire de souris en utilisant la méthode scRNA-Seq basée sur les gouttelettes. En outre, nous avons intégré deux stratégies dans le flux de travail pour profiler plusieurs échantillons dans une seule expérience. En utilisant l’une des méthodes intégrées, nous avons simultanément profilé plus de 9 000 cellules à partir de huit échantillons de cœur. Ces méthodes seront précieuses pour le domaine de la biologie du développement en fournissant un moyen rentable de profiler simultanément des cellules individuelles provenant de différents milieux génétiques, stades de développement ou endroits anatomiques.
Introduction
Le profil transcriptionnel de chaque cellule varie selon les populations cellulaires au cours du développement embryonnaire. Bien que l’hybridation moléculaire in situ unique puisse être utilisée pour visualiser l’expression d’un petit nombre de gènes1, le séquençage de l’ARNm à cellule unique (scRNA-Seq) fournit une approche impartiale pour illustrer les modèles d’expression à l’échelle du génome des gènes dans les cellules individuelles. Après sa première publication en 20092, scRNA-Seq a été appliqué pour étudier plusieurs tissus à plusieurs stades de développement au cours des dernières années3,4,5. De plus, comme l’atlas des cellules humaines a lancé récemment ses projets axés sur le développement, on s’attend à ce que davantage de données sur les cellules individuelles provenant de tissus embryonnaires humains soient générées dans un proche avenir.
Le cœur en tant que premier organe à se développer joue un rôle critique dans le développement embryonnaire. Le cœur se compose de plusieurs types de cellules et le développement de chaque type de cellule est étroitement réglementé temporellement et spatialement. Au cours des dernières années, l’origine et la lignée cellulaire des cellules cardiaques aux premiers stades de développement ont été caractérisées6, qui fournissent un outil de navigation extrêmement utile pour comprendre la pathogénie congénitale des maladies cardiaques, ainsi que pour le développement de méthodes plus avancées technologiquement pour stimuler la régénération cardiomyocyte7.
Le scRNA-Seq a subi une expansion rapide ces dernières années8,9,10. Avec les méthodes nouvellement développées, la conception et l’analyse des expériences à cellule unique est devenue plus réalisable11,12,13,14. La méthode présentée ici est une procédure commerciale basée sur les solutions droplet (voir Tableau des Matériaux)15,16. Cette méthode consiste à capturer des cellules et des ensembles de perles codées à barres uniques dans une gouttelette d’émulsion d’huile-eau sous le contrôle d’un système de contrôleur microfluidique. Le taux de chargement cellulaire dans les gouttelettes est extrêmement faible de sorte que la majorité des émulsions de gouttelettes ne contiennent qu’une seule cellule17. La conception ingénieuse de la procédure provient de la séparation d’une seule cellule en émulsions de gouttelettes se produisant simultanément avec le codage à barres, qui permet l’analyse parallèle des cellules individuelles utilisant l’ARN-Seq sur une population hétérogène.
L’incorporation de stratégies de multiplexage est l’un des ajouts importants au flux de travail traditionnel à cellule unique13,14. Cet ajout est très utile dans le rejet des doublets cellulaires, la réduction des coûts expérimentaux, et l’élimination des effets de lot18,19. Une stratégie de codage à barres basée sur les lipides et une stratégie de codage à barres à base d’anticorps (voir Tableau des matériaux) sont les deux méthodes de multiplexage principalement utilisées. Des codes-barres spécifiques sont utilisés pour étiqueter chaque échantillon dans les deux méthodes, et les échantillons étiquetés sont ensuite mélangés pour la capture d’une seule cellule, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Par la suite, les données de séquençage mises en commun peuvent être séparées en analysant les séquences de codes à barres (Figure 1)19. Cependant, des différences significatives existent entre les deux méthodes. La stratégie de codage à barres à base de lipides est basée sur des oligonucléotides modifiés par les lipides, qui n’ont pas eu de préférences de type cellulaire. Alors que la stratégie de codage à barres à base d’anticorps ne peut détecter que les cellules exprimant les protéines d’antigène19,20. En outre, il faut environ 10 min pour tacher les lipides, mais 40 min pour tacher les anticorps (Figure 1). En outre, les oligonucléotides lipides modifiés sont moins chers que les oligonucléotides conjugués aux anticorps, mais ne sont pas disponibles dans le commerce au moment de la rédaction de cet article. Enfin, la stratégie à base de lipides peut multiplex96 échantillons dans une expérience, mais la stratégie basée sur les anticorps ne peut actuellement multiplex 12 échantillons.
Le nombre de cellules recommandée au multiplexe dans une seule expérience devrait être inférieur à 2,5 x 104, sinon, il conduira à un pourcentage élevé de doublets cellulaires et la contamination potentielle de l’ARNm ambiant. Grâce aux stratégies de multiplexage, le coût de la capture d’une seule cellule, de la production d’ADNc et de la préparation de plusieurs échantillons sera réduit au coût d’un échantillon, mais le coût de séquençage demeurera le même.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré un protocole pour analyser des profils transcriptionnels d’une seule cellule. Nous avons également fourni deux méthodes facultatives aux échantillons de multiplexe dans le flux de travail scRNA-Seq. Les deux méthodes se sont avérées réalisables dans divers laboratoires et ont fourni des solutions pour exécuter une expérience de cellule unique rentable et sans effet de lot18,26.
Il y a q…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions David M. Patterson et Christopher S. McGinnis du laboratoire Dr Zev J. Gartner pour leur aimable approvisionnement en réactifs à barres à base de lipides et leurs suggestions sur les étapes expérimentales et l’analyse des données. Ce travail a été fondé par les National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
Riferimenti
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